比色法測定崗梅根總皂苷含量

劉群娣

廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學院，廣東 江門 529000

崗梅為冬青科植物梅葉冬青Ilexasprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.的干燥根。全年均可采挖，主產于廣東、廣西[1]。本品性味苦寒，有清熱解毒、生津活血的功效，主治熱病、燥渴、熱瀉、咳血、喉痛等癥[2]。據廣東韶關地區(qū)藥檢所[3]113抗菌試驗表明，崗梅根對乙型溶血性鏈球菌有輕度抑制作用，對離體豚鼠心臟注射本品，發(fā)現冠脈流量和心收縮力有所增加。在臨床上也有崗梅根用于防治各類感染的報道[4]。據麥海燕等[5]對崗梅制劑的體外抗菌試驗表明，其對上呼吸道感染常見致病菌有較好的抑菌作用。崗梅是常用的涼茶原料，常與其他清熱涼血的藥材配伍制成合劑使用，如著名的成藥王老吉、六合茶均以崗梅作為主要成分。

崗梅根中含有三萜皂苷(其中包括對-香豆酰三萜類[6]、齊敦果酸和熊果酸[7])、內酯、生物堿、氨基酸、赪酮甾醇、赪酮甾醇3-O-β-D葡萄糖苷、丁香脂素、丁香脂素-O-β-D葡萄糖苷和19-去氫烏索酸等[8]，其中皂苷類物質可能為本品藥理作用的基礎。而對于崗梅總皂苷的測定方法和結果，目前僅見馮達星等[9]以大孔樹脂富集純化崗梅根總皂苷。文中采取比色法作為測定方法，對崗梅根藥材的總皂苷進行含量測定。

1 儀器和材料

TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司生產；電子恒溫水浴鍋，汕頭市醫(yī)用設備廠生產；OFY-500藥材粉碎機，溫嶺市大德中藥機械有限公司生產；AG285電子分析天平，Mettler toledo公司生產。人參皂苷Re，購自中國藥品生物制品檢定所，批號為110754-200320。試劑均為分析純。

崗梅根為廣州的零售藥店收集，產地見表1。

表1 藥材編號及產地

將崗梅根用中藥粉碎機打碎至粉末狀，于陰涼處封裝保存，供含量測定用。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re 對照品5.2 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得對照品溶液，濃度為0.2080 mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取崗梅根粉末約1g，用濾紙包裹，置于索氏提取器中，用20 mL甲醇冷浸過夜。將甲醇浸泡液引流入圓底燒瓶中并補加50 mL新鮮甲醇，回流4 h。合并提取器和圓底燒瓶中的甲醇液，轉移至蒸發(fā)皿，水浴蒸干。殘渣用15 mL蒸餾水分3次溶解并轉移至分液漏斗。用水飽和正丁醇萃取4次，每次30 mL。合并4次正丁醇萃取液，轉移至蒸發(fā)皿，水浴蒸干。殘渣用甲醇溶解并定容至50 mL，制得供試品溶液。

2.3 測定方法 精密量取0.3 mL供試品溶液，置于60 ℃水浴加熱并吹干溶劑。加入0.2 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液(新鮮配制)和0.8 mL高氯酸，蓋塞搖勻，置于60 ℃水浴加熱15 min。取出試管并立即用冰水浴冷卻，加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻。自冰水浴冷卻算起30 min后上機測量吸光度，以545 nm作為檢測波長。每次測量并行空白，自“吹干溶劑”后平行操作。

2.4 吸收光譜的測定 取一定量的對照品溶液及按照2.2的方法制備的供試品溶液，按照2.3節(jié)的方法顯色，于400～700 nm進行光譜掃描。結果對照品溶液與供試品溶液均在545 nm波長處有最大吸收，故確定測定波長為545 nm。

2.5 方法學驗證

2.5.1 標準曲線的制備 按照最佳吸光度區(qū)間設計樣品濃度區(qū)間，取6個濃度點制作標準曲線。準確吸取對照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，按2.3節(jié)的方法顯色，在545 nm下測量吸光度，以吸光度為橫坐標、皂苷加入質量為縱坐標作圖，并計算回歸方程。其結果如圖2所示。

圖1 對照品溶液與供試品溶液的掃描圖譜(400～700 nm)

圖2 崗梅根總皂苷含量測定標準曲線

計算得回歸方程為y=4.0177x-0.0023，相關系數r= 0.9996。結果表明本方法的測定范圍0.0624 ～0.1664 mg，相當于0.3～0.8 mL對照品溶液的皂苷質量，在此測定范圍內，本方法具有良好的線性。

2.5.2 加樣回收試驗 按2.2節(jié)的方法制備某濃度的供試品溶液(X液)，并向一定量的X液中加入不同濃度的對照品溶液(R液)制成混合液，按2.3節(jié)的方法顯色，在545 nm下測量吸光度，以其差值為橫坐標、加入R液的皂苷質量為縱坐標作圖，并與標準曲線相比較。其結果如表2和圖3所示。

表2 標準加入法的回收率測定結果

圖3 標準加入法測定結果與標準曲線的比較

由表2計算得對照品的平均回收率為100.42%，回收率的RSD為1.83%，標準加入法所得曲線的相關系數r為0.9991。說明對組分復雜、有雜質存在的樣品使用本方法進行吸光度測定，仍具有良好的線性。

2.5.3 精密度試驗 取編號D的崗梅根粉末，精密稱取6份，每份約1 g，按2.2節(jié)的方法制備，每份取樣0.3 mL，按2.3節(jié)的方法顯色，在545 nm下測量吸光度。測量結果如表3所示。

表3 同一批次6份供試品的重復性試驗結果

按表3結果計算，該批次6份樣品的皂苷含量平均值為2.34%，RSD為0.76%。說明用此法測定崗梅根總皂苷的含量精密度高，完全能滿足樣品分析的要求。

3 結果

藥材的測定 準確吸取供試品溶液0.3 mL，按2.3節(jié)的方法顯色，在545 nm下測量吸光度，測定總皂苷的含量。結果見表4。

表4 5批藥材的樣品測定結果(總皂苷的百分含量) (n=2)

4 討論與結論

4.1 香草醛-高氯酸是常用的皂苷顯色反應體系。以此作為比色法的基礎，以人參皂苷Re、黃芪甲苷等穩(wěn)定的標準物質作為對照品，在同類分析研究中均已建立起成熟、穩(wěn)定的紫外測定方法，該法在百合[10]、酸棗仁[11]、甘草[12]、屏邊三七[13]等藥材的總皂苷含量測定中均得到深入的研究與應用。

4.2 實驗探索了加熱時間、加熱溫度、檢測波長和檢測時間等4個對顯色測定影響較大的因素。最后選定顯色反應條件和檢測條件為60℃加熱15 min、在545 nm下測定吸光度，放置30 min后測定，即如2.3節(jié)所述方法，在此法下方法學驗證的穩(wěn)定性、重復性最好。

崗梅有明確的藥理活性，在廣東地區(qū)作為涼茶的主要原料已使用了幾百年。然而，崗梅并未收載到《中國藥典》(2015 年版)等國家藥品質量標準中，現行的質量標準為地方標準《廣東省中藥材質量標準》(第一冊)(2004 年版)，此標準僅有性狀、鑒別、檢查項，并無含量測定內容[3]111。比色法測定崗梅根總皂苷含量，結果良好，方法學驗證數據符合要求，可作為崗梅有效部位含量測定的補充。通過進一步研究，將此法擴展到崗梅根的相關制劑的總皂苷的測定中，為崗梅根及相關制劑的質量控制提供更多有價值的方法與成果。