基于網絡藥理學探討黃芪治療2型糖尿病有效成分及作用機制

王慶學 吳雍真 李 倩 杜海洋 劉春艷 柴藝匯

貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus;T2DM)是由于胰島素抵抗與胰島β細胞功能失常導致碳水化合物、蛋白質、脂肪代謝異常，以高血糖為特征的代謝性疾病[1]。據統計，我國糖尿病患者數量位居世界首位，僅在2015年就約有130萬人因糖尿病及其并發癥死亡，且其中60歲以下占總死亡人數40.8%，呈逐漸低齡化的趨勢，并且國際糖尿病聯盟預測，到2040年我國將有1.51億糖尿病患者[2]。現階段臨床上對T2DM的治療主要為口服傳統降糖藥、注射胰島素等為主，雖可一定程度控制病情，但很難從根本上治愈T2DM[3]。因此，對T2DM的防治急需研發出安全高效的新方法。T2DM歸屬中醫“消渴”范疇，與西醫相比中醫重視辨證論治、內外并重，不僅療效良好、副作用低，還可有效緩解并發癥的發生，提高患者的生活質量。

中藥黃芪(Astragali Radix)已有2000多年的藥用史，始載于《神農本草經》，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補氣升陽、斂瘡生肌、利尿消腫、固表止汗、補益腎氣等功效[4-5]。現代藥理研究表明，黃芪在免疫調節、抗腫瘤、抗感染、糖尿病、心血管疾病等方面具有重要作用[6]。通過對臨床上治療T2DM有效的中醫藥方劑進行收集、整理、分析發現黃芪用藥頻次較高，為治療T2DM的常用藥[7]。研究顯示，黃芪甲苷可通過調節糖脂代謝、炎癥反應、胰島素抵抗等方面防治糖尿病[8]，同時臨床觀察也顯示中藥黃芪對T2DM的防治顯示出良好的療效[9]。黃芪防治T2DM具有多成分、多靶點等特點，故藥效物質基礎及作用機制難以明確。

網絡藥理學可多方位揭示藥物治療疾病的潛在作用機制，涉及多個學科的技術與知識。已有研究表明，利用網絡藥理學研究中藥的作用機制符合中醫藥整體作用特點，方法準確可靠[10]。鑒于此，本研究利用網絡藥理學，篩選藥物的活性成分及黃芪防治T2DM的潛在靶點，構建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網絡，對靶點進行富集分析，探討其潛在作用機制，為后續實驗驗證提供科學依據。

1 方法

1.1 篩選黃芪有效活性成分與T2DM靶蛋白 通過TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫搜集黃芪的化學成分；以口服生物利用度(OB)≥30，藥物相似度(DL)≥0.18為標準，篩選黃芪有效活性成分，并查詢有效活性成分相對應的靶點。在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)獲得T2DM相關靶點。所得化合物的靶點與T2DM靶點取交集，使用Cytoscape v3.7.2軟件構建藥物-活性成分-靶蛋白-疾病可視化聯系。

1.2 構建蛋白-蛋白互作網絡 將交集得到靶點導入String數據庫(https://string-db.org/)，構建蛋白質-蛋白質(PPI)互作網絡。將Degree從大至小排序，以前30為標準篩選核心靶點。

1.3 GO功能富集分析和KEGG富集分析 將1.2篩選出的核心靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov),以人類為研究對象進行GO(gene ontology)注釋和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，將P值設為小于0.01。其中GO分析包括生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)。

2 結果

2.1 黃芪有效成分及靶蛋白分析 通過TCMSP數據庫檢索關鍵詞“黃芪”獲得成分87個，通過相關條件篩選得到黃芪有效成分20個(如表1所示)，并查詢獲得有效活性成分相對應的靶點，剔除4個未查詢到靶點的活性成分，結果顯示16個活性成分共對應210個靶點。在GeneCards、OMIM數據庫檢索關鍵詞“Type 2 diabetes mellitus”，篩選得到相應靶點后取并集，刪除重復項后獲得T2DM相關靶點。將篩選獲得的有效活性成分對應的靶點與T2DM相關靶點取交集，獲得57個靶點分別對應13個活性成分。Degree排前5的有效活性成分為槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)、刺芒柄花素(formononetin)、毛蕊異黃酮(Calycosin)，這些可能為黃芪治療T2DM的關鍵有效成分(如表2所示)。利用Cytoscape軟件建立“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網絡(如圖1所示)。

表1 TCMSP數據庫篩選出黃芪有效成分

表2 關鍵有效成分

2.2 構建蛋白-蛋白互作網絡 將重合的57個靶點導入String作PPI網絡，網絡共有57個節點，512條邊(如圖2所示)，根據Degree大小排列，取前30篩選為核心靶點(如圖3所示)。將核心靶點對應的有效成分與2.1所得的5個可能為黃芪治療T2DM的有效成分取交集，結果顯示交集與之前5個有效成分相同，故推測，槲皮素、山萘酚、異鼠李素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮可能是黃芪治療T2DM的關鍵有效成分。

2.3 基因功能與通路富集分析 通過DAVID數據庫對黃芪治療T2DM的30個潛在作用的核心靶點進行分析，根據P<0.01，共得到116個GO注釋，46條KEGG通路。按P值大小，篩選出前20個GO注釋(如圖4所示)，表中GO注釋12個與BP有關，7個與MF有關，1個與CC有關，GO注釋大多與BP和MF相關，如轉錄因子結合、酶結合、基因表達正調控、RNA聚合酶II啟動子對轉錄的正調控等。

KEGG結果顯示，30個核心靶點共富集在46條通路上，主要集中在癌癥信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、病毒性心肌炎、低氧誘導因子(HIF-1)信號通路、人嗜T淋巴細胞病毒I型感染、軍團菌病、p53信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路等。P值排前20條通路(如圖5所示)。

3 討論

3.1 黃芪發揮作用的關鍵有效成分 近年來，眾多實驗及臨床觀察均證實黃芪對T2DM具有良好的療效，但對其有效成分與機制尚不明確。本研究利用網絡藥理學，構建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網絡，結果顯示黃芪13個活性成分對應T2DM的57個靶點，并通過分析獲得黃芪治療T2DM的關鍵活性成分可能為槲皮素、山萘酚、異鼠李素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮，其中，作用最強的兩個化合物均被報道有明顯降糖作用。槲皮素又名槲皮黃素，屬于黃酮類化合物，廣泛存在于植物的果實、花和葉中，具有調節血脂和血糖和清除氧自由基、抗腫瘤、抗炎等作用[11]。研究顯示，槲皮素可降低T2DM模型大鼠血糖，并有效減輕其外周胰島素抵抗，并且槲皮素也可改善被高糖抑制的神經細胞增殖活性，減少氧化應激損傷[12]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，屬于黃酮類化合物，具有調節免疫、抗病毒、抗氧化等功效。近年研究表明山奈酚在T2DM及并發癥的防治中具有很大的應用前景。山奈酚具有保護胰島β細胞功能、改善胰島素抵抗、調節血糖血脂的作用，并且對T2DM的并發癥也具有保護作用[13]。其余三個關鍵活性成分與T2DM相關報道較少，故推測這幾種活性成分與T2DM的研究較少，本研究可為后期深入探討黃芪治療T2DM的有效成分提供理論參考。

3.2 黃芪治療op的核心靶點 對黃芪治療T2DM所涉及的57個靶點進行PPI網絡的構建并分析，結果顯示Degree排前30的靶點(圖3)為血管內皮生長因子A(VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)3、白介素-6(IL-6)、表皮生長因子受體(EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)等，并推測這些靶點可能在黃芪治療T2DM中發揮關鍵作用。VEGF為內皮細胞特異性有絲分裂原，具有強大的促血管形成能力和促血管通透效應，對維持微循環系統功能正常有重要作用，而VEGFA則被認為是傳統意義上的VEGF。糖尿病狀態下，糖基化終末產物及各種細胞因子的增多、蛋白激酶C的活化等因素均可導致腎臟VEGF的表達升高[14]。在對T2DM全基因組關聯研究發現VEGFA基因上的單核苷酸多態性位點rs9369425與T2DM存在相關性[15]。IL-6是一種多功能細胞因子，在免疫、炎癥中起關鍵調節作用。T2DM患者長期處于低度炎癥的狀態下，IL-6多存在異常升高。研究顯示，黃芪多糖可調節T2DM大鼠IL-6水平，保護胰島β細胞，改善機體糖代謝狀態[16]。MAPK信號轉導通路是哺乳動物細胞內介導細胞反應的重要信號系統，普遍存在于多種生物。MAPK與T2DM關系密切，MAPK的激活可促進外周胰島素抵抗，抑制胰島素的合成與分泌，增加胰島細胞的凋亡。

3.3 主要富集通路 GO功能富集分析結果顯示，黃芪可能在轉錄因子結合、酶結合、基因表達正調控、RNA聚合酶II啟動子對轉錄的正調控等過程中起作用，發揮起防治T2DM的功效。KEGG通路富集分析結果顯示黃芪可能調控癌癥信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、病毒性心肌炎、低氧誘導因子(HIF-1)信號通路、人嗜T淋巴細胞病毒I型感染、軍團菌病、p53信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路等防治T2DM。這些通路都較為復雜，包括多個下游通路。例如顯著性最高的癌癥信號通路包括、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路等[17]。PPAR是調節目標基因表達的核內受體轉錄因子超家族成員，具有多種生物學效應。研究顯示，PPAR在T2DM中具有重要作用，其可增強機體對胰島素的敏感性、調節體內糖代謝平衡等[18]。Wnt信號通路是調控器官生長和分化的重要通路之一，與腫瘤的發生發展相關。Wnt信號通路在糖尿病發生發展中的作用已受到廣泛關注，也有研究證實，Wnt信號通路多個組成成分參與胰島β細胞的增殖、葡萄糖誘導的胰島素分泌等[19]。MAPK是一組細胞內廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其可磷酸化靶蛋白來調控信號通路，抑制肝臟對糖的輸出、降低脂肪生成和三酰甘油合成，從而發揮能量代謝功能。并且MAPK可通過上調葡萄糖轉運載體-4的表達，促進糖的吸收與利用，增加胰島素敏感性和改善胰島素抵抗[20]。此外，雌激素、TNF與胰島素具有密切關系，雌激素可影響胰島素敏感性，并且其水平降低可減弱雌激素抑制TNF釋放的作用，TNF-α抑制脂肪、肌肉細胞胰島素受體在胰島素刺激后自體硫酸化能力，并顯著降低葡萄糖轉運蛋白的表達[21]。

綜上所述，本研究初步驗證和預測黃芪治療T2DM的有效成分與分子機制，發現結果呈現多成分、多靶點、多通路的特性，可為后續深入研究其具體機制提供思路和基礎。