博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化組織中組蛋白3和組蛋白4乙酰化變化

李明瑋,張永鋒,霍 靜

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,北京 100038;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科;*通訊作者,E-mail:dr-limingwei@126.com)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是多種慢性肺臟疾病常見(jiàn)的終末病理表現(xiàn),也是慢性肺臟疾病死亡的主要原因。肺纖維化的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚,目前假說(shuō)有損傷、炎癥、修復(fù)障礙及各種原因?qū)е碌姆闻輷p傷(如氧化應(yīng)激)等。但是,上述因素均不能完全闡明其發(fā)病機(jī)制。近10年,涉及組蛋白(histone)乙酰化/去乙酰化與臟器纖維化的研究逐漸進(jìn)入人們的視線。臟器纖維化動(dòng)物模型及臨床試驗(yàn)均表明,組蛋白乙酰化是臟器保護(hù)機(jī)制[1-3]。肺纖維化初步研究證實(shí),體外培養(yǎng)的肺纖維化患者肺成纖維細(xì)胞,組蛋白乙酰化水平下降[4]。因而,為深入探討肺纖維化發(fā)病機(jī)制提供了全新的理念。

本研究擬通過(guò)博來(lái)霉素氣管給藥建立模擬肺纖維化的小鼠模型,在病程進(jìn)展過(guò)程中,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肺組織炎癥/纖維化程度及組蛋白3和組蛋白4乙酰化水平,以明確肺纖維化過(guò)程中組蛋白3和組蛋白4乙酰化在肺組織炎癥/纖維化過(guò)程中的變化情況,為探明肺纖維化潛在的機(jī)制變化,及后續(xù)靶點(diǎn)的尋找提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

博來(lái)霉素A2(日本化藥株式會(huì)社,日本),Masson染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司),蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)，總組蛋白3抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國(guó))，總組蛋白4抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國(guó))，乙酰化組蛋白3抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國(guó))和乙酰化組蛋白4抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國(guó))，PCNA抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司),TBS溶液(索萊寶生物科技有限公司)。

1.2 肺纖維化的小鼠模型建立

6-7周齡雄性C57BL/6J小鼠,SPF級(jí),購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001),飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部(許可證號(hào):SCXK(京)2015-0012)清潔級(jí)動(dòng)物房。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員倫理審查通過(guò)(倫理編號(hào):AEEI-2016-005)。獨(dú)立通氣籠盒(individual ventilated cages,IVC)系統(tǒng),飼養(yǎng)密度<5只/籠,12 h光照/12 h黑暗,室溫21-22 ℃,相對(duì)濕度50%-70%,自由飲水、攝食。

6-7周齡雄性C57BL/6J小鼠48只,隨機(jī)分為博來(lái)霉素組、鹽水組和正常對(duì)照組。腹腔注射10%水合氯醛(3.5 μl/g體質(zhì)量)麻醉小鼠,單次氣管內(nèi)給藥,博來(lái)霉素組給予博來(lái)霉素A2生理鹽水溶液2.5 μl/g體質(zhì)量(相當(dāng)于5 mg/kg體質(zhì)量)[5],鹽水組給予生理鹽水溶液2.5 μl/g體質(zhì)量。自由喂養(yǎng)。于氣管給藥后第7,14,21天,各組隨機(jī)選取動(dòng)物依次處死、取肺。

1.3 組織學(xué)檢查

將10%甲醛緩慢注入新鮮肺組織,至肺充盈漲大(內(nèi)固定),迅速置于10%甲醛固定不低于24 h。將肺組織包埋在石蠟中,制備切片(4 μm),分別進(jìn)行HE染色和Masson三色染色。

采用肺泡炎分級(jí)評(píng)分[5]評(píng)估HE染色肺泡炎癥。100倍視野下,選取所有視野進(jìn)行評(píng)分,視野選取應(yīng)避開(kāi)大氣管與大血管,取所有視野評(píng)分值的均數(shù)作為該樣本炎癥評(píng)分,采用盲評(píng)方法。

Masson染色肺組織用于纖維化分級(jí)評(píng)分[6]。100倍顯微鏡下,拍攝所有視野照片,每個(gè)視野隨機(jī)放大40倍顯微照片一張,放大視野選取避開(kāi)大氣管與大血管,取所放大照片評(píng)分值的均數(shù)作為該樣本纖維化分級(jí)評(píng)分,采用盲評(píng)方法。

1.4 組蛋白3、4乙酰化率檢測(cè)

Western blot檢測(cè)總組蛋白3(1 ∶1 000稀釋,CST,#9715),總組蛋白4(1 ∶500稀釋,CST,#2592),乙酰化組蛋白3(1 ∶1 000稀釋,CST,#9649)和乙酰化組蛋白4(1 ∶500稀釋,CST,#13534)的表達(dá),以PCNA(1 ∶1 000稀釋,碧云天,AF0261)作為內(nèi)部參照,使目標(biāo)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。使用SDS-PAGE(分離膠12%,積層膠5%)分離變性核蛋白樣品(100 ℃,5 min;每個(gè)泳道50 μg)。通過(guò)電轉(zhuǎn)印跡將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫用含有5%脫脂奶粉的TBS溶液封閉2 h。在4 ℃下,一級(jí)抗體孵育過(guò)夜。加二級(jí)抗體是熒光羊抗兔IgG(1 ∶10 000)或熒光羊抗鼠IgG(1 ∶10 000),室溫孵育2 h。使用Odyssey LI-COR SA雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描成像,分析蛋白條帶。組蛋白乙酰化率=乙酰化組蛋白/總組蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況

小鼠造模后飼養(yǎng)過(guò)程中,存在自然死亡,博來(lái)霉素組死亡8只、鹽水組死亡2只、空白對(duì)照組死亡0只。博來(lái)霉素組4只小鼠發(fā)生下肢運(yùn)動(dòng)障礙,均伴有下肢皮膚紫紺、脫毛、肌肉萎縮、皮溫厥冷。

2.2 肺泡炎評(píng)分

通過(guò)對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行HE染色觀察各組肺泡炎情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肺泡炎癥博來(lái)霉素組明顯重于鹽水組,博來(lái)霉素組廣泛肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔明顯增厚,實(shí)質(zhì)區(qū)明顯增多,肺泡內(nèi)及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),給藥后7 d病變呈局灶性,給藥后14 d呈彌漫性>20%肺組織,嚴(yán)重時(shí)>50%肺組織,伴有出血(紅色箭頭),肺大泡(向左箭頭),甚至官腔閉合(三角箭頭),給藥后21 d時(shí)肺組織病變更重(見(jiàn)圖1)。博來(lái)霉素組在氣管給藥后7,14,21 d時(shí)肺泡炎評(píng)分均顯著高于鹽水組(見(jiàn)表1)。博來(lái)霉素組肺泡炎評(píng)分峰值出現(xiàn)在第14天,第7天與第14天差異顯著。說(shuō)明博來(lái)霉素氣管給藥,誘導(dǎo)肺泡炎,持續(xù)進(jìn)展,給藥后第14天達(dá)到高峰,隨后趨于平穩(wěn),逐漸下降。

圖1 小鼠肺組織病理HE染色鏡下表現(xiàn) (×400)Figure 1 HE staining of pulmonary tissues in mice (×400)

表1 各組肺泡炎評(píng)分比較

2.3 肺纖維化評(píng)分

通過(guò)對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行Masson染色觀察各組肺纖維化情況,結(jié)果顯示,博來(lái)霉素組肺纖維化明顯重于鹽水組,博來(lái)霉素組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡間隔廣泛增厚明顯(隔厚度≥3X正常),部分間質(zhì)纖維化毗連呈墻,甚至條塊狀膠原纖維沉積于肺間質(zhì)(紅色箭頭),嚴(yán)重時(shí)肺泡腔被膠原纖維填滿(實(shí)三角形),肺泡間隔消失,正常肺泡結(jié)構(gòu)不能保留,膠原纖維條塊連結(jié)成片(>顯微鏡視野50%)(見(jiàn)圖2)。博來(lái)霉素組在氣管給藥后7,14,21 d肺纖維化評(píng)分均顯著高于鹽水組(見(jiàn)表2)。博來(lái)霉素組肺纖維化評(píng)分進(jìn)行性升高,峰值出現(xiàn)在第21天。說(shuō)明博來(lái)霉素氣管給藥后,纖維化持續(xù)進(jìn)展,給藥后7-14 d變化急劇,14-21 d變化趨于平穩(wěn)。

表2 各組肺纖維化評(píng)分比較

圖2 小鼠肺組織病理Masson染色鏡下表現(xiàn) (×400)Figure 2 The pathological changes of pulmonary tissues by Masson staining (×400)

2.4 肺組織組蛋白3乙酰化率

Western blot檢測(cè)組蛋白3、乙酰化組蛋白3(acetylated histone 3,AcH3)表達(dá),通過(guò)乙酰化組蛋白3/組蛋白3計(jì)算組蛋白3乙酰化率。結(jié)果顯示,博來(lái)霉素組組蛋白3乙酰化率顯著低于空白對(duì)照組(0.859±0.188vs0.900±0.203,P=0.049);博來(lái)霉

素組組蛋白3乙酰化率顯著低于鹽水組(0.859±0.188vs1.076±0.165,P=0.000,見(jiàn)圖3)。

與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與鹽水組比較,##P<0.01圖3 小鼠肺組織組蛋白3乙酰化率Figure 3 The acetylation rate of histone 3 in the lung tissue of mice

氣管給藥后,博來(lái)霉素組第7天(0.855±0.183vs1.037±0.142,P=0.041)、14天(0.797±0.224vs1.186±0.160,P=0.000)組蛋白3乙酰化率顯著低于鹽水組;然而,第21天兩組無(wú)顯著差異(0.927± 0.159vs0.951±0.103,P=0.832,見(jiàn)圖4)。組蛋白3乙酰化率博來(lái)霉素組谷值出現(xiàn)在第14天,第21天逐漸回升至正常;鹽水組峰值出現(xiàn)在第14天,21天逐漸下降至正常,兩組變化趨勢(shì)相反。

2.5 肺組織組蛋白4乙酰化率

Western blot檢測(cè)組蛋白4、乙酰化組蛋白4(acetylated histone 4,AcH4)表達(dá),通過(guò)乙酰化組蛋白4/組蛋白4計(jì)算組蛋白4乙酰化率。博來(lái)霉素組組蛋白4顯著低于空白對(duì)照組(0.971±0.067vs1.016±0.096,P=0.043);博來(lái)霉素組組蛋白4顯著低于鹽水組(0.971±0.067vs1.039±0.097,P=0.003,見(jiàn)圖5)。

博來(lái)霉素組組蛋白4乙酰化率在氣管給藥后第7天(0.976±0.091vs1.094±0.121,P=0.006)、第14天(0.932±0.026vs1.017±0.060,P=0.045)顯著低于鹽水組;第21天兩組無(wú)顯著差異(1.002±0.044vs0.980±0.068,P=0.662,見(jiàn)圖6)。博來(lái)霉素組組蛋白4乙酰化率谷值出現(xiàn)在第14天,與鹽水組比較變化趨勢(shì)相異(見(jiàn)圖6)。

與鹽水組比較,*P<0.05,**P<0.01B.各組小鼠肺組織組蛋白3乙酰化率的比較圖4 小鼠肺組織組蛋白3乙酰化率隨給藥時(shí)間的變化Figure 4 Changes of histone 3 acetylation rate in the lung tissues of mice along with the administration time

與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與鹽水組比較,##P<0.01圖5 小鼠肺組織組蛋白4乙酰化率Figure 5 The changes of histone 4 acetylation rate in the lung tissue of mice

2.6 小鼠肺組織病理評(píng)分與組蛋白乙酰化相關(guān)性

組蛋白3乙酰化率與肺泡炎評(píng)分負(fù)相關(guān)(r=-0.458,P雙側(cè)=0.002);與肺纖維化評(píng)分不存在相關(guān)性(見(jiàn)圖7)。組蛋白4乙酰化率與肺泡炎(r=-0.495,P雙側(cè)=0.001)、纖維化(r=-0.396,P雙側(cè)=0.010)病理評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(見(jiàn)圖7)。

圖7 小鼠肺組織組蛋白乙酰化率與病理評(píng)分相關(guān)性Figure 7 Correlation between histone acetylation rate and pathological scores in the lung tissues of mice

2.7 組蛋白乙酰化對(duì)肺纖維化病變影響

二元線性回歸分析:以肺泡炎評(píng)分作為因變量,自變量組蛋白4乙酰化率、組蛋白3乙酰化率標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)分別為-0.422、-0.362,均P<0.01,標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)絕對(duì)值組蛋白4乙酰化率大于組蛋白3乙酰化率,提示乙酰化率降低對(duì)肺泡炎的作用,組蛋白4強(qiáng)于組蛋白3。以纖維化評(píng)分作為因變量,組蛋白4乙酰化率與纖維化評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.412,P=0.010),組蛋白3乙酰化率與纖維化評(píng)分無(wú)相關(guān)性,提示乙酰化率降低對(duì)肺纖維化作用,組蛋白4強(qiáng)于組蛋白3。

與鹽水組比較,*P<0.05,**P<0.01B.小鼠肺組織組蛋白4乙酰化率在氣管給藥后的比較圖6 小鼠肺組織組蛋白4乙酰化率隨時(shí)間的變化Figure 6 Changes of histone 4 acetylation rate in the lung tissue of mice along with the administration time

3 討論

肺纖維化的病理過(guò)程包括肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥和纖維細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,導(dǎo)致肺泡壁增厚,導(dǎo)致出現(xiàn)慢性不可逆的肺功能下降。典型癥狀包括干咳、氣短和運(yùn)動(dòng)受限[7]。空氣污染、吸煙和病毒感染被認(rèn)為可能是造成肺纖維化的原因,然而迄今為止,肺纖維化的發(fā)病機(jī)制仍然不完全清楚,阻止肺纖維化進(jìn)展的藥物方案仍然有限[8]。本研究主要探索肺纖維化可能涉及的分子變化。研究表明組蛋白乙酰化/去乙酰化平衡在纖維化進(jìn)程及其基因調(diào)控中起重要作用[9],組蛋白去乙酰化修飾組蛋白,可以改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)型,調(diào)控基因表達(dá),其平衡失控是纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)力[10]。在臟器纖維化的進(jìn)程中,組蛋白去乙酰化是細(xì)胞的活化、分化、凋亡基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵開(kāi)關(guān)。

博來(lái)霉素處理肺纖維化小鼠的肺成纖維細(xì)胞中,因組蛋白去乙酰化酶2和組蛋白去乙酰化酶4的表達(dá)升高導(dǎo)致的組蛋白乙酰化水平降低,進(jìn)而導(dǎo)致凋亡因子Fas表達(dá)下降,促使肺成纖維細(xì)胞凋亡敏感性降低,從而抑制成纖維細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生[11]。研究顯示組蛋白去乙酰化機(jī)制與抑制抗纖維化因子COX-2、IP-10啟動(dòng)子區(qū)的異染色質(zhì)蛋白1、以及Thy-1等關(guān)系密切[4,12],通過(guò)乙酰化水平的改變,調(diào)控基因的表達(dá),進(jìn)而影響纖維化的形成。

本研究通過(guò)博來(lái)霉素誘導(dǎo)建立肺纖維化動(dòng)物模型,檢測(cè)肺組織組蛋白3、組蛋白4乙酰化水平,及二者隨肺泡炎到肺纖維化的動(dòng)態(tài)改變。結(jié)果顯示,發(fā)生肺纖維化時(shí),肺組織組蛋白3、組蛋白4的乙酰化水平均降低,這一變化與既往文獻(xiàn)基本一致。在肺成纖維細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中,組蛋白3和/或組蛋白4在LPS誘導(dǎo)的肺纖維化過(guò)程中乙酰化水平降低[12]。

本研究顯示小鼠肺纖維化早期(給藥7 d)組蛋白3、組蛋白4的乙酰化水平呈進(jìn)行性下降趨勢(shì),隨后逐漸回升。組蛋白3與組蛋白4相比較,組蛋白4乙酰化反應(yīng)更為敏感,肺纖維化早期組蛋白4乙酰化水平下降更為顯著,回升更為迅速。相關(guān)性分析提示,組蛋白4去乙酰化既與肺泡炎關(guān)系密切,也與肺纖維化關(guān)系密切,組蛋白3去乙酰化在肺纖維化的進(jìn)程中僅與肺泡炎關(guān)系密切;多元回歸分析顯示,組蛋白3去乙酰與肺泡炎的密切性弱于組蛋白4去乙酰化。本研究初步探索組蛋白去乙酰化參與肺纖維化進(jìn)程,組蛋白4與組蛋白3比較,去乙酰化反應(yīng)更為敏感、影響更為廣泛。組蛋白4乙酰化作為纖維化的標(biāo)記,研究也更為廣泛,新近的研究顯示,丙戊酸作為組蛋白去乙酰化酶類(lèi)抑制劑,能夠顯著減少心房的擴(kuò)張和纖維化;與其能夠顯著升高心房中組蛋白4乙酰化水平有關(guān)[13]。

本研究中,組蛋白乙酰化水平在肺纖維化過(guò)程中后期出現(xiàn)回升,組蛋白4乙酰化率甚至出現(xiàn)反超對(duì)照組的現(xiàn)象。在腎臟損傷研究中,損傷后近端腎小管細(xì)胞中乙酰化組蛋白瞬時(shí)減少,24 h后逐漸恢復(fù),這一變化可持續(xù)3周[14],同時(shí)發(fā)現(xiàn)這一變化與管狀上皮細(xì)胞的修復(fù)相關(guān)[15]。因此,本研究結(jié)果提示在肺纖維化變化的過(guò)程中,組蛋白由早期的去乙酰化轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴；?/p>

另外,本研究發(fā)現(xiàn),鹽水組與空白對(duì)照組小鼠比較,組蛋白乙酰化水平升高,組蛋白3乙酰化水平升高更為明顯,病程早期即迅速升高;組蛋白4乙酰化升高水平不顯著。因試驗(yàn)設(shè)計(jì)要驗(yàn)證博來(lái)霉素氣管給藥的造模效果,需設(shè)立給藥溶劑組即鹽水組進(jìn)行對(duì)照,以排除溶劑對(duì)造模效果的影響。但是鹽水氣管給藥也并非生理過(guò)程,對(duì)呼吸系統(tǒng)屬于一種物理刺激。這一結(jié)果提示一方面鹽水氣管給藥作為一種物理刺激,誘發(fā)肺組織組蛋白乙酰化水平一過(guò)性升高,組蛋白3乙酰化在此過(guò)程中反應(yīng)更為敏感、迅速;另一方面,鹽水作為誘導(dǎo)藥物博來(lái)霉素的溶劑,并沒(méi)有促進(jìn)組蛋白乙酰化水平下降的作用,這從側(cè)面反應(yīng)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型,組蛋白乙酰化水平降低,結(jié)果可信。

總之,本研究揭示肺纖維化的表觀遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制的冰山一角,組蛋白3與組蛋白4的乙酰化變化深度參與肺纖維化進(jìn)程,為通過(guò)調(diào)控組蛋白乙酰化水平治療肺纖維化,甚至逆轉(zhuǎn)病程,找到了可靠的檢測(cè)標(biāo)記。此外,組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶對(duì)組蛋白乙酰化水平具有調(diào)控作用,本研究為針對(duì)該乙酰轉(zhuǎn)移酶制定的肺纖維化藥物提供了可靠的治療參考標(biāo)記[16],為后續(xù)相關(guān)研究的開(kāi)展打下基礎(chǔ)。