補腎養血明目方基于線粒體途徑對RPE 細胞凋亡的保護作用研究

陳強，梁麗娜，莊曾淵

視網膜色素上皮 （retinal pigment epithelium，RPE） 細胞在眼的結構和視覺功能中起著十分重要的作用。RPE 雖然是色素上皮細胞，卻具有神經細胞不可再生的特性，一旦死亡只能依靠臨近的RPE細胞擴張和移行填充死亡細胞占據的空間[1]。諸多研究[2-3]證實，RPE 細胞的損傷或增殖在許多視網膜疾病的病程進展中起著重要的作用，它主要參與了年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）、增生性玻璃體視網膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）、視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）等多種視網膜疾病的發生發展。因此，保護RPE 細胞正常生理性結構、功能和數量，抑制RPE 細胞的損傷變性，已成為治療AMD、RP 等疾病的新方向。課題組前期研究[4-5]發現補腎養血明目方對RPE 細胞氧化應激損傷有保護作用，其作用靶點可能與線粒體有關。本文擬著重探討補腎養血明目方基于線粒體途徑對RPE 細胞凋亡的保護作用，以揭示其防治AMD 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

ARPE-19 細胞購自于中國典型培養物保藏中心細胞庫。PBS 緩沖液及HBSS 緩沖液（博士德）；氫醌 （Hydroquinone，HQ）（Sigma-Aldrich）；DMEM/F12高糖培養基（HyClone）；0.25%胰蛋白酶消化液（Solarbio）；胎牛血清（Gibco）；TUNEL 檢測試劑盒（德國Roche）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、線粒體/胞漿制備試劑盒 （北京普利萊基因技術有限公司）；Cytochrome c Profiling ELISA 試劑盒（abcam）。CO2培養箱（Thermo）；SYNERGYTM H1 酶標儀（美國BioTek公司）；熒光分光光度計（美國Perkin Elmer 公司）；熒光顯微鏡（Leica）。

空白腸吸收液的制備[4]：以不含藥物的臺氏緩沖液制備得到，儲存在-80℃冰箱備用。補腎養血明目方含藥腸吸收液的制備：參照文獻[5]制備補腎養血明目方含藥腸吸收液，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后分裝至無菌Eppendorf 管中，-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 RPE 細胞培養RPE 細胞接種于含10%FBS的DMEM/F12 培養液中，置于5%CO2、37℃細胞培養箱中常規培養，細胞貼壁后，每2～3 d 更換1 次培養液，接近融合狀態時消化傳代。

1.2.2 HQ 誘導建立RPE 細胞氧化損傷模型 參照此前方法[5]，以終濃度為90 μM 的HQ 作為造模濃度，置于細胞培養箱中孵育24 h，誘導建立ARPE-19 細胞氧化應激損傷模型。

1.2.3 細胞分組及處理 將細胞分為正常組：常規培養液培養；模型組：90 μM 的HQ 作用24 h；空白對照組（對照組）：空白腸吸收液干預24h 后，加入90 μM的HQ 作用24 h；腸吸收液干預組（干預組）：補腎養血明目方含藥腸吸收液干預24 h 后，加入90 μM 的HQ 作用24 h。

1.3 觀察指標

1.3.1 含藥腸吸收液對細胞活力的影響 細胞接種于96 孔板，HQ 誘導后采用不同濃度含藥腸吸收液（0.5%、1%、2%、5%）作用24 h 后，棄上清液，PBS 緩沖液洗滌細胞3 次，每孔加入100 μL DMEM 和10 μL CCK-8 試劑的混合液，37℃孵育3 h 后，采用酶標儀于450 nm 波長測定各孔吸光度值（OD 值）。按照下列公式計算細胞活力抑制率：抑制率（%）=（OD 值正常組－OD 值腸吸收液組）/OD 值正常組×100%。

1.3.2 細胞色素C（cytochrome c，Cyt-c）含量的測定胰酶消化收集各組細胞，參照試劑盒說明書分離細胞胞漿成分，經過BCA 法蛋白定量，各樣品調整為一致的蛋白濃度。采用Cyt-c 定量ELISA 試劑盒測定，具體操作按試劑盒說明書進行。樣品經過酶聯免疫反應后顯色，測定450 nm 吸光值（OD 值）間接反映樣品中Cyt-c 的含量。

1.3.3 檢測細胞線粒體膜通透轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放Calcein-AM作為一種敏感的活細胞染料，可用于檢測線粒體內膜通透性的改變[6]。具體操作如下：胰酶消化收集各組細胞，進行如下操作： 空白對照管中，加入含鈣HBSS 重懸細胞；其余各組細胞分為2 管，加入含鈣HBSS 重懸細胞后，其中一管加入2 μL Calcein-AM工作液（2 μM），另一管加入2 μL Calcein-AM 工作液（2 μM）和2 μL CoCl2，輕輕混勻后，37℃避光孵育15 min；1000 rpm 離心5 min，棄上清液；用HBSS 洗滌1 次，1000 rpm 離心5 min，棄上清液；加入HBSS輕輕混勻細胞后用熒光分光光度計檢測分析： 設置激發光488 nm，發射光為517 nm。

1.3.4 TUNEL 檢測RPE 細胞凋亡 對數生長期ARPE-19 細胞以1.0×106/mL 的濃度接種于預先放置蓋玻片的6 孔培養板中，每組設置一個平行復孔。各組細胞經相應處理后吸出細胞培養液，按照TUNEL 檢測試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡下計數RPE 凋亡細胞及RPE 細胞總數，計算凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數/同視野RPE 細胞總數×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS17.0 統計學軟件完成統計學分析，各組實驗數據通過正態性分布、方差齊性檢驗后，以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ARPE-19 細胞形態

ARPE-19 細胞鏡下呈現扁梭形、圓形或多角形的細胞形態，貼壁良好，胞漿內未見明顯黑色素顆粒。不同處理組之間的細胞形態未見明顯差異（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下ARPE-19 細胞形態圖。1A 低倍鏡下（×100）；1B 高倍鏡下（×200）

2.2 對RPE 細胞活力的影響

與正常組比較，HQ 誘導后ARPE-19 細胞活力降低（t=19.466，P=0.000）。與模型組比較，干預組（濃度分別為1%，2%，5%）RPE 細胞活力提高（t1%=-4.309，P=0.002；t2%=-9.503，P=0.000；t5%=-4.008，P=0.003），濃度為2%時細胞活力最好（表1）。

表1 含藥腸吸收液對HQ 誘導的ARPE-19 細胞活力的影響（n=6）

2.3 對RPE 細胞mPTP 開放的影響

與正常組比較，HQ 誘導后的模型組ARPE-19細胞Calcein 平均熒光強度下降（t=8.398，P=0.000）；與模型組比較，干預組Calcein 平均熒光強度提高（t=-5.521，P=0.001），對照組無明顯變化（t=-0.512，P=0.623）；與對照組比較，干預組Calcein 平均熒光強度提高（t=-5.009，P=0.001）（表2）。

2.4 對RPE 細胞胞漿Cyt-c 含量變化的影響

ELISA 法分析Cyt-c 含量顯示，與正常組比較，模型組ARPE-19 細胞胞漿Cyt-c 含量升高（t=-9.987，P=0.000）；與模型組比較，干預組ARPE-19 細胞胞漿Cyt-c 含量降低（t=2.968，P=0.018），對照組無明顯變化（t=0.251，P=0.808）；與對照組比較，干預組Cyt-c 含量降低（t=2.717，P=0.026）（表2）。

表2 含藥腸吸收液對氧化應激損傷ARPE-19 細胞mPTP開放及胞漿Cyt-c 含量變化的影響（，n=3）

表2 含藥腸吸收液對氧化應激損傷ARPE-19 細胞mPTP開放及胞漿Cyt-c 含量變化的影響（，n=3）

注：* 與正常組比較，P<0.05；& 與模型組比較，P<0.05；# 與對照組比較，P<0.05

2.5 對RPE 細胞凋亡的影響

正常組幾乎沒有凋亡陽性細胞。與正常組比較，HQ 誘導后模型組可發現ARPE-19 細胞凋亡現象（t=-6.564，P=0.000）。與模型組比較，干預組ARPE-19 細胞凋亡率下降（t=2.360，P=0.029），對照組凋亡率無明顯變化（t=-0.572，P=0.573）；與對照組比較，干預組細胞凋亡率下降（t=2.932，P=0.008）（圖2、表3）。

表3 含藥腸吸收液對氧化應激損傷ARPE-19 細胞凋亡的影響（，n=6）

表3 含藥腸吸收液對氧化應激損傷ARPE-19 細胞凋亡的影響（，n=6）

注：* 與正常組比較，P<0.05；& 與模型組比較，P<0.05；# 與對照組比較，P<0.05

3 討論

圖2 TUNEL 檢測各組ARPE-19 細胞凋亡情況圖片（×200）。凋亡細胞陽性呈紅色。2A 正常組；2B 模型組；2C 對照組；2D 干預組

AMD 是50 歲以上人群視力喪失的主要病因，伴隨人口老齡化，其發病率呈逐年上升趨勢[7-8]。雖然目前對AMD 病因的認識尚不十分清楚，但吸煙已被國內外學者公認為首要危險因素。香煙中的焦油含有高濃度的氧化劑前體，其中HQ 的含量最高。體內或體外實驗[9-12]均表明，吸煙或HQ 引起的RPE細胞的氧化應激損傷可能在AMD 的發生和發展中起著重要作用。為此，課題組選擇HQ 為誘導因素造模，通過建立RPE 細胞體外氧化損傷模型，探討補腎養血明目方的作用機制。

補腎養血明目方是莊曾淵研究員多年的臨床經驗方，方藥組成包括枸杞子、淫羊藿、黃芪、石斛等，其中枸杞子、淫羊藿補益腎精，黃芪、當歸益氣養血，石斛滋陰明目，諸藥合用，共奏補腎養血明目功效。現代藥理學研究發現，枸杞多糖能抑制藍光照射對體外培養的人RPE 細胞的損傷作用[13]。淫羊藿苷可以明顯減少糖尿病大鼠心肌膠原含量及心肌線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，高劑量淫羊藿苷明顯抑制了心肌線粒體丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，增加了心肌線粒體超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性[14]。尾葉遠志無論總提取物還是萃取所得各組分，在高濃度時對羥自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除作用，顯示出較強的抗氧化作用[15]。課題組前期發現補腎養血明目方可以增加RPE 細胞內ATP 水平，減少ROS 的生成，減輕線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）損傷[5]。根據RPE 細胞氧化損傷機制、補腎養血明目方的組成功效及現代藥理學研究結果推測，補腎養血明目方很可能通過線粒體途徑發揮對RPE 細胞氧化應激損傷的保護作用，從而阻止或延緩了AMD 的發生和發展。近年來，我國學者探索出了含藥腸吸收液的體外藥理研究方法，模擬復方的體外吸收過程，該體系能較好地反映出復方進入體內的化學成分。本研究亦通過腸吸收液的方法來觀察補腎養血明目方的干預效果，與傳統的含藥血清法相比，該方法不僅去除了復方的非吸收成分及其他雜質，也無含藥血清的自身內源性成分對實驗的干擾。

HQ 可誘導細胞出現氧化損傷，使細胞活力降低，造成非致死性損傷。本研究表明，補腎養血明目方腸吸收液可抑制ARPE-19 細胞損傷，細胞活性檢測表明終濃度為2%的含藥腸吸收液保護效果最好，因此在后續實驗均采用濃度2%的腸吸收液進行干預。

線粒體是真核動物細胞進行生物氧化和能量轉換的主要場所，細胞生命活動所需能量的80%是由線粒體提供的。Cyt-c 是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，是一種相對分子量為1.45×104的水溶性蛋白質，位于線粒體膜間隙，穩定地結合于線粒體內膜，不能通過外膜。本研究的結果提示RPE 細胞損傷過程中Cyt-c 的釋放與線粒體外膜通透性增高有關。線粒體外膜蛋白聚合形成膜通透轉運孔（permeability transition factor，PTP） 復合體，PTP 復合體是一種高電導非選擇性通道，許多因素如Ca2+、氧自由基、pH 改變都可觸發PTP 開放[16]。當氧化應激發生時，ROS 的積累導致線粒體的膜系統受到損害，線粒體外膜通透性增加，跨膜電位降低，使線粒體膜間腔的凋亡蛋白Cyt-c 釋放入細胞質中，誘導細胞凋亡[17]。本研究的結果揭示了補腎養血明目方可通過抑制RPE 細胞mPTP 開放，減少線粒體Cyt-c 的釋放從而減少RPE 細胞凋亡，線粒體的保護是其實現保護作用的重要途徑。研究結果為臨床應用和新藥研發提供了理論依據。