一例河蟹病原體腐敗希瓦菌的檢測診療與分析

陳 瑜 李 勇 倪 亞

(1.泗陽縣三莊鄉農業經濟技術服務中心，江蘇 泗陽 223700；2.泗陽縣水產技術指導站，江蘇 泗陽223700；3.泗陽縣倪亞水產技術服務中心，江蘇 泗陽 223700)

2019 年8 月26 日筆者接診泗陽縣南劉集漁場黃某的河蟹病樣，進行病原細菌的分離培養與檢測，并對分離純化得到的病原菌株進行了藥物敏感性試驗。經檢測該塘河蟹致病菌為腐敗希瓦菌，該菌株對硫酸新霉素最為敏感，對其他試驗藥物敏感性較差。這一檢測結果應用于塘口治療效果較為顯著，具體情況如下。

一、病情概述

1.蟹農主訴：年初扣蟹放養規格160 只/千克、密度2 500只/畝，8月底平均規格雄蟹125克/只、雌蟹75 克/只。自8 月初陸續發現河蟹零星死亡，從最初15～20 只/天逐漸發展，1 周后上升至80～100只/天，8月26日200多只發病死亡。其間于當地漁藥店多次購藥治療，先后連續21 天服用過恩諾沙星、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶鈉，改底與調水3次，消毒1次，但不見任何效果，病蟹數量不降，越來越多。

2.接診察看：發病塘口面積30 畝，池形東西長、南北寬，四周環溝寬4米、水深1米，塘中淺水面平均水深0.6 米，水草占比60%。池塘水源充沛、進排水方便。巡塘發現，病蟹趴邊、無力、反應遲鈍、遇驚不退避，少數病蟹上岸吐沫、易捕捉、翻身不起，外觀體色灰暗、四肢較干凈。

3.解剖檢查：蟹鰓絲棒樣水腫，部分黑鰓、爛鰓，腸無食，胃內泡沫樣脹氣，肝胰腺呈暗黃色、無光澤。

4.寄生蟲檢查：低倍鏡(×10)顯微檢查鰓絲及附肢絨毛，未見固著類纖毛蟲寄生。

5.水質檢測：上午10:00檢測水質，水體溶解氧5.3 毫克/升、pH 8.3、氨氮0.2 毫克/升、亞硝酸鹽0.01毫克/升。

6.水樣鏡檢：池水中以小球藻、柵藻、盤星藻、裸藻等藻類為主，浮游動物見少許橈足類，其浮游生物量豐度適中。

二、病菌分離純化培養與藥物敏感性試驗

選取具有典型癥狀瀕死河蟹，于無菌操作實驗室內進行細菌分離純化培養檢測鑒定和菌株對藥物感受性試驗。實驗前用75%酒精擦拭消毒河蟹體表，于無菌操作凈化臺內進行無污染解剖，剪取肝胰腺少許，放入盛有15 毫升經高壓滅菌營養肉湯增菌液的50 毫升離心管中，放置于生化培養箱28℃、24 小時增菌培養；18～24 小時后對擴增培養的細菌進行普通營養瓊脂平板劃線分離接種，重置于生化培養箱中28℃、24 小時培養；18～24 小時挑取培養皿單一菌落，再次劃線分離純化培養(28℃、24 小時)；24 小時后挑取菌落配制成0.5 麥氏濁度菌懸液，按照梅里埃API-20E細菌鑒定試劑條操作流程，將菌懸液滴加到試劑條每個生化反應小杯管中，置于恒溫生化培養箱中37℃、24 小時培養，18～24 小時比色判讀鑒定。另外，用無菌棉簽蘸取1個菌落進行氧化酶反應試驗比色判讀。鑒定結果：API-20E 生化序號為0600004，菌株為腐敗希瓦菌，鑒定率97.2%，革蘭氏染色陰性、桿菌。菌株生化反應鑒定判讀結果見表1。

表1 API-20E鑒定試劑條生化反應判讀結果

同時，用移液槍吸取配制好的0.5麥氏度菌懸液0.2毫升，加到20毫升無菌生理鹽水中在V形槽內混勻，然后用微量移液排槍吸取加入到藥敏板所有微孔中(陰性對照除外)，每孔加0.2毫升，置于35℃培養箱培養18～24 小時。藥敏試驗操作依據南京菲恩動物用藥敏分析96 孔試劑板操作流程。試驗結果見表2。

藥敏試驗表明：本次河蟹染病病原體腐敗希瓦菌對8種所試藥物的感受性，對硫酸新霉素強敏感，MIC 為0.39 微克/毫升，為本次疾病治療的首選用藥；而恩諾沙星為25微克/毫升、鹽酸多西環素為50 微克/毫升、磺胺甲噁唑＋甲氧芐啶為(512＋102)微克/毫升，病原菌株對這3 種藥物耐受性極強，屬低敏感度，最小抑菌濃度值相對較高，用藥的血藥濃度必須達到較高峰值才可抑菌見效，選藥上要慎重，盡量不選；其他4種藥物在設置濃度試驗范圍內無法抑制病菌繁殖，該菌株對其耐藥，選藥時徹底舍棄。

三、試驗結果應用

經實驗室檢測診斷此次河蟹致病病原體為腐敗希瓦菌。癥狀表現為鰓絲水腫，部分爛鰓，胃脹氣，腸炎，蟹背胸甲潰瘍、腐殼等。應用菌株藥敏試驗結果，篩選試驗強敏感藥物硫酸新霉素處方內服，劑量為河蟹每千克體重5 毫克(以新霉素計)，每天1 次，連用7 天，同時外潑氨基酸碘1次。治療3天后死蟹減半，5天后減少至10 只/天，7 天后死蟹消失，河蟹攝食量上升，活力變強，病情得以控制。

四、分析與小結

1.本病例提示細菌性病害應求病原鑒定與藥敏試驗選藥的精準性，不可囿于以往的盲選藥物。此病例在沒做藥敏試驗前，養殖戶選恩諾沙星、氟苯尼考、磺胺類等藥物用了21 天未見效果，其原因在于此病致病菌為腐敗希瓦菌，而經藥敏試驗，該菌株對恩諾沙星、鹽酸多西環素、氟苯尼考、甲砜霉素、氟甲喹、磺胺類等表現為低敏甚至不敏，盲目用藥必致無效。相反，找準極敏感藥物硫酸新霉素給病蟹用藥，效果立顯。

2.本次藥敏試驗發現，當地腐敗希瓦菌對多種藥物都有較強耐藥性，這給因該菌株感染的病害防控選藥上帶來一定的困難，增加了治療難度。

3.本病例如排除池塘生態環境誘病因素外，應當考慮河蟹長期投喂冰凍海魚的影響，一些已變質而未被發現的凍魚投喂是否存在攜帶腐敗希瓦菌病原的可能性，有待于進一步溯源檢測。

表2 8種藥物對河蟹腐敗希瓦菌株最小抑菌濃度(MIC)試驗結果 微克/毫升