腫瘤轉移抑制基因LASS2/TMSG1全長及其截短體對人前列腺癌細胞生物功能的影響

劉浩云，裴 斐,2

前列腺癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家常年位居男性惡性腫瘤的發病率首位[1]。近年我國前列腺癌的發病率也呈明顯上升趨勢[2-3]。腫瘤轉移是多數癌癥患者死亡的最終原因。腫瘤轉移抑制基因1(tumor metastasis suppressor gene1, TMSG1)[4-5]與腫瘤轉移密切相關，又被稱為人源長壽保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue 2, LASS2)[6]以及神經酰胺合成酶2(ceramide synthase 2, CerS2)[7]。LASS2/TMSG1定位于1q21.3，包含10個外顯子，基因全長2 029 bp。LASS2/TMSG1編碼一個含有380個氨基酸，相對分子質量為4.5×104的蛋白。生物信息學分析LASS2/TMSG1主要由Homeobox(Hox)結構域(71-128aa)以及TLC結構域(131-332aa)構成，其中Hox結構域內包含一個核定位信號(119-128aa)。

本實驗旨在構建LASS2/TMSG1基因全長質粒以及3個結構域缺失質粒，并穩定轉染到人前列腺癌高轉移細胞系PC-3M-1E8中，以進一步探究LASS2/TMSG1基因中TLC結構域、Hox結構域以及Hox結構域中的核定位信號序列對人前列腺癌細胞生物學功能的影響，并探討是LASS2/TMSG1基因中哪個結構域對其發揮抑制腫瘤生長、轉移和侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1 材料嘌呤霉素(Puromycin)購自美國Amresco公司；Polybrene(Hexadimethrine bromide Matrigel)購自北京普利智誠公司；DAPI染液購自北京索萊寶公司；Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG購自北京博奧森公司；Matrigel購自美國BD公司；FLAG M2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；Transwell-24膜嵌套(6.5 mm直徑，8.0 μm孔徑PC膜)購自美國Corning公司。

1.2 LASS2基因全長以及3個截短體引物設計使用GenBankΔ數據庫檢索基因cDNA序列，使用軟件Premier 5.0軟件進行引物設計。

1.3 LASS2基因全長以及3個截短體質粒構建T1(Δ71-128)去除了Hox結構域；T2(Δ128-332)去除TLC結構域；T3(Δ118-128)去除了Hox結構域中的核定位信號(圖1)。以LASS2-pcDNA3.0質粒為模板，采用非依賴DNA聚合酶的連接方法(Exonuclease Ⅲ購自日本Takara公司)進行連接。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR反應產物回收后與載體(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro)混合在Exonuclease Ⅲ反應體系中4 ℃冰浴1 h，加入感受態細胞中轉化30 min，45 ℃熱激90 s，4 ℃冰浴2 min，將反應產物涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃ 14～16 h，挑選單克隆并行菌液PCR檢測，檢測符合者送測序。

圖1 LASS2基因全長以及3個截短體序列示意圖

1.4 Western blot法將細胞用RIPA裂解液裂解后提取細胞總蛋白，進行12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，200 mA穩流濕轉2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗FLAG M2(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜；TBST洗脫3次，每次10 min；二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h；TBST洗脫3次，每次10 min；ECL發光液按照A液 ∶B液=1 ∶1的比例進行配置，化學發光儀檢測化學發光信號。

1.5 細胞免疫熒光實驗在6孔板底部放上多聚賴氨酸處理的玻片，將細胞接種于6孔板中，于孵育箱中培養，待細胞密度長至70%～80%時，PBS漂洗細胞2次，4%多聚甲醛室溫固定15 min；PBS洗滌細胞10 min；0.1%TritonX100室溫孵育10 min；PBS洗滌細胞3次，每次10 min；1%山羊血清室溫封閉1 h；一抗FLAG M2(1 ∶1 600)4 ℃孵育過夜；PBS洗滌細胞3次，每次10 min；二抗Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶500)室溫避光孵育1 h；PBS洗滌細胞3次，每次10 min；DAPI染核(1 ∶100)，室溫避光孵育10 min；PBS洗滌細胞10 min；90%甘油封片。實驗重復3次。

1.6 軟瓊脂集落形成實驗底層軟瓊脂配制：配制0.8%低熔點瓊脂糖并高壓滅菌，6孔板每孔按照體積比為：0.8%低熔點瓊脂糖 ∶2×DMEM ∶小牛血清=4.5 ∶4.5 ∶1的比例配制底層膠液體，6孔板每孔加入3 mL，每種細胞設置3個復孔，4 ℃放置30 min；上層膠用1.2%低熔點瓊脂糖，其余同底層膠。取150 μL細胞密度為1×104/mL的細胞懸液加入上層軟瓊脂液體中并混合均勻，6孔板每孔加入3 mL，4 ℃放置30 min；于孵育箱中培養21天；于倒置顯微鏡下進行細胞集落計數以及細胞集落直徑測量。實驗重復3次。

1.7 細胞劃痕修復實驗將細胞以每孔3×105個的數量接種于6孔板中，設置3個復孔，于孵育箱中培養48 h，待細胞單層生長鋪滿孔底，用10 μL無菌槍尖以直尺為標準在孔底進行劃痕，每孔等距離平行劃痕5道；PBS溶液清洗至無細胞碎片為止，每孔加入2 mL不含血清的RPMI 1640培養液，于孵育箱中培養，用倒置顯微鏡觀察并采集每孔細胞在劃痕后0、9、18 h時的細胞圖像并計量遷移速率。實驗重復3次。

1.8 Transwell細胞侵襲實驗在Transwell小室的下室中加入30%小牛血清200 μL作為趨化因子，在Transwell小室的聚碳酸酯膜(PC膜)上加入50 μL的用無血清DMEM培養液稀釋的Matrigel(1 ∶7)，將整個24孔板放置于37 ℃培養箱中聚合30 min。將細胞以1×105的數量，總體積150 μL均勻地加入Transwell小室的上室，設置3個復孔，于孵育箱中培養48 h后吸去Transwell小室上室的多余液體，4%多聚甲醛室溫固定15 min；0.1%結晶紫溶液室溫染色15 min；PBS溶液洗去多余染液，倒置顯微鏡觀察并進行圖像采集。實驗重復3次。

2 結果

2.1 構建穩定轉染LASS2基因全長以及3個截短體的人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8以LASS2/TMSG1-pcDNA3.0質粒為模板，采用非依賴DNA連接酶的連接方法構建慢病毒質粒系統，其中，T1截短體全長972 bp，T2截短體全長534 bp，T3截短體全長1 114 bp，LASS2全長1 143 bp(圖2A)。隨后，采用慢病毒感染人前列腺癌高轉移潛能細胞系PC-3M-1E8(LASS2/TMSG1低表達)，并利用慢病毒質粒系統所帶有的嘌呤霉素抗性基因進行篩選，得到穩定細胞系后再采用Western blot法進行檢測，實驗結果顯示，LASS2/TMSG1全長蛋白分子質量在(4.0～5.0)×104之間(實際分子質量為4.5×104)，T1截短體蛋白分子質量在(3.5～4.0)×104之間，T2截短體蛋白分子質量在(1.5～2.5)×104之間，T3截短體蛋白分子質量在(4.0～5.0)×104之間(圖2B)。與預測的分子質量相符合：T1截短體蛋白分子質量35.64×103，T2截短體蛋白分子質量19.58×103，T3截短體蛋白分子質量40.85×103。

圖2 A.菌液PCR技術檢測構建的LASS2基因全長質粒以及3個截短體質粒；B.Western blot法檢測構建的LASS2基因全長以及3個截短體質粒所表達的蛋白

2.2 人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8中LASS2基因全長以及3個截短體蛋白的分布應用免疫熒光技術對LASS2基因全長以及3個截短體所表達的蛋白進行追蹤并利用激光共聚焦顯微鏡對結果進行觀察，在穩定轉染LASS2基因全長以及3個截短體的人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞中均可見蛋白大部分定位于細胞質中(圖3)。

2.3 LASS2基因全長以及3個截短體對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8增殖能力的影響采用軟瓊脂集落形成實驗檢測LASS2基因全長以及3個截短體序列對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞非錨定依賴性生長能力的影響，結果顯示：Vector組集落數量遠大于LASS2基因全長組(P<0.001)以及T1組(P<0.001)和T3組(P<0.001)，T2組集落數量與Vector組相比差異無顯著性(圖4A、B)。Vector組集落直徑與LASS2基因全長組(P<0.001)以及T1組(P<0.001)、T2組(P<0.001)和T3組(P<0.001)組相比差異均有顯著性(圖4C)。

2.4 LASS2基因全長以及3個截短體對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞遷移能力的影響采用細胞劃痕修復實驗檢測LASS2基因全長以及3個截短體序列對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞遷移能力的影響，計算18 h后細胞的劃痕修復率，結果顯示，Vector組劃痕修復率與LASS2基因全長組(P<0.001)、T1組(P<0.001)、T2組(P<0.001)和T3組(P<0.001)組相比差異均有顯著性(圖5)。

2.5 LASS2基因全長以及3個截短體對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞侵襲能力的影響應用Transwell細胞侵襲實驗檢測LASS2基因全長以及3個截短體序列對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞侵襲能力的影響，結果顯示，Vector組在細胞侵襲方面與LASS2基因全長組(P<0.001)、T1組(P<0.001)、T2組(P<0.001)和T3組(P<0.001)相比差異均有顯著性(圖6)。

3 討論

LASS2/TMSG1在抑制腫瘤遷移方面具有重要作用。有研究表明，LASS2/TMSG1在低轉移前列腺癌細胞系PC-3M-2B4中高表達，在高轉移前列腺癌細胞系PC-3M-1E8中低表達[8]。同時，也有研究發現在高轉移乳腺癌細胞系MDA-MB-231中過表達LASS2/TMSG1可以抑制細胞增殖能力、非錨定依賴性生長能力以及細胞侵襲能力[9]。

LASS2/TMSG1是由北京大學基礎醫學院病理學系腫瘤生物學研究室于1999年率先利用mRNA差異顯示技術首次克隆出來的腫瘤轉移抑制基因[4-5]。生物信息學分析主要由Hox結構域(71-128aa)以及TLC結構域(131-332aa)構成，其中Hox結構域內包含一個核定位信號(119-128aa)。

現有研究表明神經酰胺合成酶的催化活性位于TLC結構域[10-11]。在所有的Lag同源體中Lag模體對于發揮酶活性是必須的[11]。

本組構建的T2截短體就特異性的刪除了LASS2基因的TLC結構域。根據實驗結果顯示，T2截短體對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞的影響具有雙重性。穩定轉染了LASS2基因T2截短體序列的人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞的增殖、遷移、侵襲均受顯著抑制(P均<0.001)，在細胞凋亡方面以及非錨定依賴性生長方面并無明顯改變，但在錨定依賴性生長(P<0.001)方面卻顯著增強。其中涉及的具體機制可能并不只限于神經酰胺所參與的信號通路，具體機制還有待分析。

圖3 免疫熒光技術檢測LASS2基因全長以及3個截短體基因序列所編碼的蛋白在人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8中的分布情況

圖4 A.軟瓊脂集落形成實驗檢測各穩定細胞系非錨定依賴性生長能力；B.在軟瓊脂集落形成實驗中各穩定細胞系形成的克隆數統計結果；C.在軟瓊脂集落形成實驗中各穩定細胞系形成的克隆直徑統計結果；**P<0.05；***P<0.001；ns.差異無統計學意義

圖5 A.細胞劃痕修復實驗檢測各穩定細胞系的細胞遷移能力；B.各穩定細胞系18 h時的劃痕修復率；***P<0.001

圖6 A.Transwell細胞侵襲實驗檢測各穩定細胞系的細胞侵襲能力；B.48 h細胞侵襲數；***P<0.001

本實驗構建的T1截短體特異性的刪除LASS2基因的Hox結構域，T3截短體特異性的刪除了LASS2基因Hox結構域中的核定位信號。Hox結構域在擁有Hox結構域的神經酰胺合成酶中的確切作用還未確定，但是也沒有證據可以證明Hox結構域在神經酰胺合成酶家族中充當轉錄因子的作用。對于神經酰胺合成酶中的Hox結構域現有許多不同的觀點存在，但綜合這些觀點可以得知神經酰胺合成酶中的Hox結構域并不具備充當轉錄因子識別特異性序列的作用，而是可能擁有其他重要的作用，例如調節神經酰胺合成酶的催化活性。以上論述也符合本實驗中觀察到的現象，在人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8以及人胚胎腎細胞HEK-293T中均可以見到LASS2基因全長序列以及3個截短體序列所編碼的蛋白質大部分均定位于細胞質中，并未進入細胞核中行使轉錄調節的作用。

細胞內的微觀世界紛繁復雜，正常的各項人體生理活動涉及許多復雜且精密的代謝調控以及信號轉導，改變一個分子的表達或許涉及到許多我們還未發現的信號轉導通路以及代謝活動。本實驗結果顯示，LASS2基因T1截短體序列與LASS2基因全長序列相比，對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞具有更明顯的抑制作用，LASS2基因T2、T3截短體序列在對人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8細胞中則表現出了雙重性。這些現象的背后一定涉及了許多未知的調控機制，還有待我們在后續工作中進行深入探索。