基于ERK和NF-κB途徑探討洋金花醉茄內酯Daturataturin A抑制HaCaT細胞增殖和遷移的作用

魏政，蘇慧琳，匡海學*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

洋金花是白花曼陀羅屬一年生草本植物，具有止咳平喘、止痛鎮靜的作用，可用于治療銀屑病，療效確切[1]。近年來的研究表明，醉茄內酯具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]和免疫抑制[5]效應。筆者推測洋金花中某些醉茄內酯，尤其是Daturataturin A(DTA)可能對表皮細胞生物學具有重要影響。醉茄內酯是一系列28C原子的甾體衍生物，在側鏈C20位置上有一個δ內酯[6]。近年來,醉茄內酯類化合物的抗炎和對細胞毒性的影響已有報道,NF-κB信號通路是主要的藥理靶標，可以調節各種生理過程,如細胞增殖、發展、免疫、細胞凋亡、炎癥和代謝[6]。

銀屑病是一種慢性復發性皮膚炎癥，其主要病理表現為表皮角質形成細胞的異常增殖。表皮細胞NF-κB和ERK等異常激活，導致過度增殖、遷移、炎癥等生物學進程。因此，本研究基于ERK和NF-κB途徑，對洋金花醉茄內酯Daturataturin A(DTA)誘導HaCaT增殖、遷移、炎癥及相關分子機制進行研究，從而探討其治療銀屑病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

抗體NF-кB、抗體ERK、抗體p-ERK、抗體PCNA、HRP-標記的羊抗兔IgG、HRP-標記的羊抗鼠IgG(上海碧云天生物技術有限公司)；IL-6、IL-8和 TNF-α ELISA試劑盒、CCk-8試劑(南京恩晶生物科技有限公司)。

1.2 洋金花的提取分離和Daturataturin A的精制

取干燥洋金花，用40倍量70%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，合并提取液，冷卻至室溫，靜置，濾過。濾液回收溶劑至濃縮液無醇味后，用0.1%的鹽酸溶液5倍于濃縮液體積浸提6～8次，濾過。將此濾液進行732型陽離子交換樹脂柱色譜，流速3 BV/h，流出液繼續進行AB-8型大孔吸附樹脂柱色譜，流速2.5 BV/h，吸附完全后用純水將樹脂洗至流出液還原糖反應陰性，用50%乙醇4 BV洗脫，最后用95%乙醇洗脫回收溶劑。結合前期藥理學及化學成分研究，其中水洗脫部分主要含有水溶性雜質，95%乙醇洗脫部分主要含有脂溶性色素。50%乙醇洗脫組分中主要含有黃酮類化合物和甾體類化合物，是治療銀屑病的藥效物質基礎，即經大孔樹脂得洋金花50%乙醇洗脫組分。

對50% EtOH洗脫部分以葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜進一步分離，依次用水、MeOH進行洗脫，得到水洗脫組分(醉茄內酯類化合物)和甲醇洗脫組分(黃酮類化合物)。采用反相柱色譜和HPLC等現代方法對水洗脫組分進行分離，得到精制的Daturataturin A。

1.3 細胞培養

HaCaT細胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青-鏈霉素的高糖DMEM培養基培養，以2.5%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細胞；48 h更換新的培養液。培養條件為37 ℃、5%CO2。

1.4 增殖、遷移、抗炎實驗

采用CCK-8法檢測并分析藥物的量-效關系和時-效關系；WST-1、中性紅、結晶紫聯合測試藥物對細胞不同細胞器靶點的影響；HaCaT細胞克隆形成實驗測試DTA的抗增殖效應;細胞遷移實驗采用細胞劃痕法和transwell法;ELISA法檢測炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α 的表達情況。

1.5 免疫蛋白印跡法檢測ERK、NF-κB、PCNA的表達

將細胞消化后，制成單個細胞懸液，均勻的分裝至25 cm2培養瓶，使用相應完全培養液于37 ℃、5% CO2條件下培養。至細胞鋪滿80%，加入相應劑量的含藥物的完全培養基中培養24 h或48 h，收獲細胞。細胞裂解在4 ℃進行，所有試劑均預冷。首先，以PBS(pH值7.4)洗細胞，孵育在新鮮添加1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(含Na3VO4100 mmol/L，PMSF 1 mmol/L)30 min，每瓶600 μL。用細胞刮刀收集細胞，4 ℃，13 000×g離心20 min，取上清液。BCA法測定蛋白質含量。加入4×負載緩沖液后，煮沸5 min，將15 μg蛋白裝入聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(SDS-PAGE)。利用圖像分析軟件(Analytik Jena, Jena，德國)對蛋白條帶進行分析，確定目標蛋白與內參的比值。核蛋白的提取按照制造商的說明書(solarbio，北京)進行。

1.6 統計學處理

實驗數據處理采用SPSS 20.0軟件進行，對各組數據進行方差齊性檢驗，若P>0.05,則方差具有齊性，多組比較釆用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-ttest ；若P<0.05，則方差不齊，采用單因素方差分析，并使用Brown-Forsythe或Welch校正，兩兩比較采用Durmett’s T3檢驗。檢驗結果以均數±標準差表示。P≤0.05表示有統計學意義，并應用Prism 5顯示平均值和標準差的直方圖。

2 結果

2.1 DTA抑制HaCaT增殖呈劑量和時間依賴關系

首先，應用CCK-8實驗測定DTA(化學結構如圖1f所示)對HaCaT抑制活性的量-效和時-效作用，實驗重復3次，單次實驗設置6個復孔，每隔6 h設為測試的時間點，并應用Prism 5利用平均值和標準差擬合量-效曲線。DTA 30 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L對HaCaT呈量效依賴的抑制作用(圖1a、圖1c和表1、表2)。 24 h和48 h的IC50分別為32.74 μmol/L和26.07 μmol/L(圖1b、圖1d)。30 μmol/L DTA對HaCaT的抑制活性隨時間遞增，大約在24 h起到明顯抑制增殖作用(圖1e和表3)。

注：a.24 h CCK-8實驗；b.24 h量效曲線；c.48 h CCK-8實驗；b.48 h量效曲線；e.30 μmol/L DTA的時效曲線；f.Daturataturin A化學結構。圖1 DTA抑制HaCaT活性的初步研究

表1 DTA作用于HaCaT細胞24 h的增殖抑制率

表2 DTA作用于HaCaT細胞48 h的增殖抑制率

表3 DTA在不同時間點作用于HaCaT細胞的增殖抑制率

克隆形成實驗是比較敏感的測定細胞增殖能力的實驗方法。利用多功能成像儀 (Analytik Jena,Jena，德國)及其配套的圖像分析軟件拍攝并計算克隆形成率。細胞以單個分散的形式接種在6孔板內，數日后，單個細胞不斷復制形成克隆，計算克隆形成率，可以直觀的反應細胞的增殖能力。腫瘤細胞大多具有克隆生長的能力，HaCaT細胞是永生化的表皮細胞，也具有較弱的克隆能力。在克隆形成實驗，7.5 μmol/L DTA能夠明顯抑制HaCaT增殖(P<0.05)，然而30 μmol/L DTA幾乎完全抑制克隆形成(圖2a、圖2b和表4)。

圖2 DTA抑制HaCaT細胞克隆形成

表4 DTA影響HaCaT細胞克隆形成率

2.2 DTA抑制IL-17誘導的HaCaT過度增殖

以IL-17誘導的HaCaT細胞作為銀屑病模型，研究DTA的抗增殖作用。在同一個96孔板樣本中，采用WST1、中性紅、結晶紫三聯測，分別顯示DTA對線粒體、溶酶體、細胞膜三個細胞器靶點的作用。我們發現IL-17 50 ng/mL可誘導HaCaT過度增殖(P<0.05)；DTA 7.5 μmol/L (P<0.05), 15 μmol/L (P<0.05) 和30 μmol/L (P<0.01)可劑量依賴的逆轉這種趨勢(圖3a、圖3b、圖3c和表5、6、7)。三個不同的細胞器靶點實驗顯示，DTA 7.5 μmol/L對溶酶體的抑制并無顯著意義，提示溶酶體中可能存在其他細胞保護作用的生物學進程(圖3b和表6)。

注：a. WST-1;b.中性紅;c.結晶紫依次在一個樣本中的連續測試;IL-17(50 ng/mL)添加到除空白組之外的各實驗組，實驗重復3次，單次實驗設置6個復孔。圖3 WST-1、中性紅、結晶紫三聯測試DTA抑制過度活化的HaCaT

表5 WST-1測試DTA抑制HaCaT細胞的過度增殖

表6 中性紅測試DTA抑制HaCaT細胞的過度增殖

表7 結晶紫測試DTA抑制HaCaT細胞的過度增殖

2.3 DTA抑制HaCaT的遷移能力

細胞劃痕實驗顯示DTA抑制HaCaT劃痕愈合能力(圖4a、圖4b和表8)。Transwell實驗顯示了DTA可抑制HaCaT單細胞遷移(圖4c、圖4d和表9)。Transwell實驗拍攝照片后，用33%乙酸抽提樣本，酶標儀測520 nm波長吸光度，OD值代表遷移細胞的相對含量，結果顯示與鏡下細胞計數的方法相似(圖4e和表10)。

檢測到30 μmol/L DTA可抑制總ERK的表達(P<0.05)，磷酸化的ERK可劑量依賴式的被DTA抑制(7.5 μmol/L；15 μmol/L,P<0.05；30 μmol/L,P<0.01)(圖5a、圖5b和表11)。

注：a和b為24 h細胞劃痕實驗；c、d、e為12 h Transwell實驗;與Control比較， *P<0.05，**P<0.01。圖4 DTA抑制HaCaT細胞遷移

注：與Control比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 DTA抑制HaCaT細胞遷移的始動因子ERK

表8 DTA抑制HaCaT細胞劃痕愈合

表9 Transwell實驗檢測DTA抑制HaCaT細胞遷移計數

表10 Transwell實驗聯合結晶紫抽提檢測DTA抑制HaCaT細胞遷移的相對計數

表11 免疫印跡檢測DTA抑制HaCaT細胞遷移的始動因子ERK和p-ERK與內參的比值

2.4 DTA抑制持續活化的NF-κB

作為炎癥信號分子，NF-κB在多種腫瘤細胞高水平表達，同時，抑制NF-κB會導致腫瘤細胞增殖活性減弱。Cyclin D1是NF-κB的下游信號，表明炎癥信號和增殖信號之間的關系[7]。NF-κB進入細胞核，激活轉錄因子,隨后對細胞的增殖,存活和炎癥反應有一系列的影響。筆者發現HaCaT細胞持續高表達NF-κB，免疫熒光顯示強烈的NF-κB細胞核染色信號，這可能與HaCaT細胞永生化的特性有關。隨著DTA(15 μmol/L,30 μmol/L,P<0.05)用量增加，在24 h，NF-κB免疫染色平均光密度顯著降低，30 μmol/L DTA組NF-κB信號幾乎完全消失(圖6a、圖6b和表12)。DTA(7.5 μmol/L, 15 μmol/L,P<0.05；30 μmol/L,P<0.01)可顯著降低核內NF-κB/p65的表達(圖6d和表12)。此外，PCNA在S期DNA合成是必需的，DTA(15 μmol/L,30 μmol/L,P<0.05)降低PCNA免疫染色平均光密度(圖6a、圖6c和表12)；DTA(7.5 μmol/L, 15 μmol/L,P<0.05；30 μmol/L,P<0.01)可顯著降低核內PCNA的表達(圖6e和表12)。

炎癥因子分泌的ELISA測定，顯示30 μmol/L DTA可顯著降低IL-6、IL-8、TNF-α的分泌(圖7a、圖7b、圖7c和表13)，其抗炎作用與抗銀屑病藥物Tretinoin (1 μmol/L)(P<0.05)相似。

表12 免疫印跡和免疫熒光檢測DTA抑制HaCaT細胞NF-κB和PCNA的表達

注：與Control比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 DTA 抑制持續活化的 NF-κB和下游的增殖信號

注：與Control比較，*P<0.05，**P<0.01。圖7 DTA抑制分泌性的炎癥因子

表13 ELISA 檢測DTA作用下的HaCaT細胞IL-6、IL-8和TNF-α 的分泌

3 討論

銀屑病是一種慢性復發性皮膚炎癥，其主要病理表現為表皮角質形成細胞的異常增殖。銀屑病的臨床表型有尋常型銀屑病、斑點狀銀屑病、反向銀屑病、紅皮病型牛皮癬和膿皰性銀屑病[8]。現已經提出許多假說來推測銀屑病可能的病理模型。銀屑病的臨床表現為厚鱗屑，并伴有組織病理學改變，是以表皮角化為主要特征的一種疾病。然而，銀屑病病理生理學的發現揭示了這種紊亂機制,角質形成細胞的過度增殖是銀屑病的重要機制之一。

近年來提出了一種涉及IL-23/Th17免疫軸的銀屑病致病模型[9]。在與這個軸相關的分子中，IL-17是影響銀屑病的關鍵因子，并已開發出針對其的相應生物制劑[10-11]。IL-17激活核factor-kappa B (NF-κB)信號通路，并引起下游一系列細胞增殖和炎癥進程。本研究顯示DTA可抑制IL-17誘導的HaCaT過度增殖，可能是治療銀屑病的機制之一。

表皮角質形成細胞作為原駐的天然免疫細胞，可防御外來的有害物質侵襲，充當免疫衛兵的作用。激活的 NF-κB是一個含有p65和p50亞基二聚體的轉錄因子。NF-κB經IκB激酶誘導后與IκB分離，進入到細胞核而影響特殊靶基因序列。多種刺激可以激活NF-κB信號轉導通路，包括TNF-α、IL-1、IL-17、病毒和脂多糖。銀屑病患者皮損處相比于健康者 NF-κB表達上調[12]。作為炎癥關鍵性調節因素，NF-κB可以調節各種細胞因子、趨化因子、黏附分子和酶的轉錄。也影響炎性細胞因子的產生，如TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8。此外，NF-κB激活能影響角質細胞在銀屑病皮損中的分化和增殖[13]。NF-κB是天然免疫的主要信號途徑，銀屑病患者角質形成細胞的產生與反應異常的炎性細胞因子有關，包括TNF-α， IL-6和IL-8[9]，本研究顯示了DTA可抑制持續活化的NF-κB及其下游的炎癥因子。

蛋白激酶是信號網絡的重要組成部分，可以使細胞作為有機體的一個組成部分發揮作用。胞外信號激酶ERK(Extracellular signaling kinase, ERK)，磷酸化并轉運至核內，參與了細胞增殖[14]和遷移[15]的多種進程。ERK和NF-κB存在著交互作用，本研究顯示DTA抑制ERK的磷酸化水平，進而抑制HaCaT增殖、遷移和炎癥進程。

醉茄內酯是一類廣泛存在于茄科植物中的有活性的化合物。隨著分子結構和藥理研究的進展，其具有良好的抗癌作用的報道越來越多。茄科植物分布廣泛，為其天然產物的結構和藥理研究提供了大量資源。筆者研究結果揭示了洋金花醉茄內酯DTA可有效抑制HaCaT增殖和遷移，其機制可能是通過抑制炎癥信號分子NF-κB和ERK進行的。這可能是洋金花制劑治療銀屑病的作用機制之一。