京大戟對斑馬魚胚胎血管生成的影響

梁文舉，倪璐，張文婷，陳揚，劉妍，劉靜，趙苑伶,林瑞超，郝巨輝,馬志強*

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102; 2.中藥品質評價北京市重點實驗室，北京 100102)

研究表明，抗血管新生療法是以血管內皮細胞為靶點，通過降低血管活性因子的活性、抑制內皮細胞增殖和遷移、改變腫瘤生長微環境，從而抑制腫瘤生長過程所必需的血管新生，切斷腫瘤的供養，最終達到遏制腫瘤生長和轉移目的一種腫瘤治療方法[1-2]；該方法具有高效特異性、不易產生耐藥性、藥物易于到達靶部位和毒副作用小等優點，可以有效地抑制腫瘤的生長、轉移和復發，現在已成為抗腫瘤血管生成藥物研究的熱點之一[3-4]。在抗血管藥物活性篩選中，斑馬魚因其高通量，給藥方便、胚胎透明、胚胎發育快、血管生成模式簡單且在顯微鏡下可直接觀察到血管形態等優點，已成為篩選抗血管生成藥物的理想動物模型[5]。

前期研究表明，京大戟水提物具有抗血管新生活性，但其物質基礎尚未明確[6]。活性導向是對中藥化學成分分離、探索中藥活性物質基礎的重要方法。故本研究采用斑馬魚為模型動物，以抗血管生成活性為前提，探究京大戟不同極性提取部位對斑馬魚胚胎血管生成的影響，為闡明京大戟抗血管生成的化學物質基礎提供依據。

1 實驗材料

1.1 主要儀器和試藥

京大戟飲片(購自河北安國藥材市場，經北京中醫藥大學中藥學院楊瑤珺教授鑒定為正品)；斑馬魚循環水養殖系統(北京愛生科技公司)；Axio Zoom V16體式熒光顯微鏡(Zeiss，Germany)；HQ10-20H超純水儀(長沙聚豐環保科技有限公司)；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ5200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BPZ-6033LC真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；MS205DU電子分析天平(瑞士METTLER公司)；LRH-250Z型恒溫生化培養箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)；10 μL、200 μL、1 mL、5 mL移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗動物

轉基因斑馬魚Tg(flk1:mCherry)(中國科學院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心)。

1.3 試劑與耗材

氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈣、七水硫酸鎂、碳酸氫鈉等均為分析純(北京化工廠)；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純(北京化工廠)；15 cm玻璃培養皿，12孔板、錫箔紙、巴斯德吸管，Vatalanib 2HCl(PTK787)(Selleck Chemicals,Houston,TX)。

2 方法

2.1 斑馬魚成魚飼養及胚胎繁殖

飼養條件：北京愛生斑馬魚繁殖系統，全封閉循環，水溫(28±0.5)℃，pH值7.2～7.4，電導率530～550 μs/cm，14 h∶10 h明暗交替。

胚胎繁殖：選擇生長狀態良好的斑馬魚以雌雄比為1∶1進行繁殖，用隔板將雌雄斑馬魚分開，于次日清晨抽去隔板，繁殖完成后，將成魚取出放回養殖系統，收集狀態良好的斑馬魚胚胎，置于28.5 ℃恒溫培養箱孵育。

胚胎培養水的配制：按照Zebrafish Book標準配制：0.137 mol/L NaCl、5.4 mol/L KCl、0.25 mol/L Na2HPO4、0.44 mol/L K2HPO4、1.3 mol/L CaCl2、1.0 mol/L MgSO4、4.2 mol/L NaHCO3的水溶液。

2.2 京大戟不同極性部位的提取

京大戟飲片粉碎過40目篩，稱取20 g，精密稱定，置索氏提取器中，分別以10倍體積量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇為提取溶劑，按序依次回流提取，每次提取均至索氏提取器回流管中提取液無色，更換提取溶劑時需揮干上一種提取溶劑，分別收集各提取液，減壓濃縮，真空干燥至恒重，稱重研磨粉碎待用。

2.3 京大戟不同極性部位對斑馬魚胚胎血管生成的影響

在體式顯微鏡下挑選發育良好且胚胎發育至6 hpf(hours past fertilization，即受精后小時數)的魚卵。將挑出的魚卵置于12孔板中，每孔20只胚胎，分別暴露在3 mL不同對照組及供試組溶液中。根據預實驗結果，以含有0.1% DMSO的胚胎培養水作為溶劑，分別配置濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的京大戟石油醚提取物(PET)、二氯甲烷提取物(DCM)、乙酸乙酯提取物(EA)，以及濃度為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL甲醇提取物(MeOH)供試品溶液。同時，給予濃度為100 ng/mL的PTK787為陽性對照組；以及含有0.1% DMSO的胚胎培養水為空白對照組。每24 h更換一次培養液，在28 ℃下、在14 h/10 h的晝夜周期中培養至72 hpf，在體式顯微鏡下觀察節間血管生成情況并拍照，統計完整節間血管數[完整的血管指的是斑馬魚節間血管能夠連接背縱吻合血管(DLAV)和背主動脈(DA)的節間血管]。平行重復3次。

2.4 京大戟甲醇提取部位的不同洗脫組分對斑馬魚胚胎血管生成的影響

根據不同極性部位結果，選取毒性較低，活性較好的甲醇部位進行下一步硅膠柱層析分離純化，使用20% ～ 100%的甲醇水溶液梯度洗脫，得到20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇,共5組洗脫組分，減壓濃縮，真空干燥至恒重，稱重研磨粉碎待用。以含有0.1% DMSO的胚胎培養水作為溶劑，均配置成濃度為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的供試品溶液，顯微鏡下選取發育良好且胚胎發育至6 hpf的魚卵，按“2.3”項下處理，對洗脫部位的活性進一步進行考察。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 京大戟不同極性部位對斑馬魚節間血管生成的影響

結果顯示，空白對照組斑馬魚節間血管生長良好，節間血管呈均勻縱向排列，完整無缺失，無斷裂。陽性對照組斑馬魚體節間血管缺失明顯。石油醚提取部位處理組處理組斑馬魚節間血管均勻縱向排列，完整無缺失，對斑馬魚胚胎血管生長無明顯抑制作用(P>0.05)，二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇提取部位3組處理組斑馬魚節間血管均出現血管缺失現象，對斑馬魚胚胎血管具有明顯的抑制作用，且隨著給藥濃度的升高，抑制作用增強。但在實驗過程中，觀察到經石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取部位處理過的斑馬魚幼魚在所有濃度下均出現卵黃腫大、體態彎曲和部分死亡現象，且隨著劑量增大，死亡和致畸數量增多，在40 μg/mL以上全部死亡，這一現象表明這三種極性提取部位毒性較強。具體見表1、圖1。

表1 京大戟不同極性部位對斑馬魚節間血管生成情況的影響

注：A.石油醚組；B.二氯甲烷組；C.乙酸乙酯組；D.甲醇組。圖1 京大戟不同極性部位對斑馬魚胚胎節間血管生成的影響

3.2 京大戟甲醇層不同部位對斑馬魚節間血管生成的影響

結果顯示，空白對照組斑馬魚節間血管生長良好，節間血管呈均勻縱向排列，完整無缺失，無斷裂。陽性對照組斑馬魚體節間血管缺失明顯。5組京大戟不同甲醇洗脫部位處理組均出現血管缺失現象，即5個處理組的血管生成均受到一定程度的抑制。在統一設定的3個濃度下，20%甲醇和80%甲醇洗脫部位對斑馬魚節間血管的抑制呈濃度依賴性；其余3個處理組的抑制效果無濃度依賴關系。具體見表2、圖2。

3.3 京大戟20%、80%甲醇洗脫部位和甲醇提取物抑制血管生成活性對比

對京大戟甲醇提取部位與20%、80%甲醇洗脫部位進行比較，結果顯示，在相同給藥劑量下，甲醇提取部位和20%、80%甲醇洗脫部位對斑馬魚節間血管生成均有抑制效果，且隨著濃度增大，抑制效果增強。其中20%、80%甲醇洗脫部位抑制效果強于甲醇提取部位。具體見圖3。

表2 京大戟甲醇不同組分部位對斑馬魚節間血管生成情況的影響

注：A.20%甲醇洗脫部位；B.40%甲醇洗脫部位；C.60%甲醇洗脫部位；D.80%甲醇洗脫部位；E.100%甲醇洗脫部位。圖2 京大戟甲醇提取物不同部位對斑馬魚節間血管的抑制作用

注：A.甲醇提取部位；B.20%甲醇洗脫部位；C.80%甲醇洗脫部位。圖3 京大戟20%、80%甲醇洗脫部位和甲醇提取物抑制血管生成活性比較

4 討論

新血管的形成能加速腫瘤的生長發育并促進轉移，腫瘤新生血管的形成是以血管生成的方式發生的[7-8]，若能抑制腫瘤血管生成，則可達到抑制腫瘤生長和轉移的目的，因此，“抗血管生成療法”已成為腫瘤靶向治療的重要研究領域之一[9]。

前期研究表明，京大戟水提物具有抗血管生成效果，其中mRNA結果顯示，京大戟水提物可抑制部分腫瘤血管生成的相關基因的表達，但其物質基礎尚未明確[6]。本研究以抗血管生成活性為導向，采用血管熒光標記的轉基因斑馬魚為模型動物，探究京大戟石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇四種不同極性部位提取物對斑馬魚胚胎節間血管的影響。結果顯示，京大戟石油醚提取物對斑馬魚胚胎節間血管生成無抑制作用，剩余三種對斑馬魚胚胎節間血管生成具有抑制作用，且均呈劑量依賴性。這可能是由于三種有機試劑在提取過程中存在不同極性成分的重疊造成的，即使用不同極性的溶劑在連續提取過程中無法將成分按照極性的不同區分開。此外，不同極性的提取溶劑在斑馬魚胚胎毒性表現上具有較大的區別。石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯三種提取部位具有較強的毒性，在較低的給藥范圍內，斑馬魚胚胎均出現體態彎曲、卵黃腫大，乃至死亡。在相同療效下，甲醇提取物組雖給藥濃度較大，但安全性更好，在給藥范圍內，未出現致畸和死亡現象。

本研究結果表明二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇三種不同極性提取部位對斑馬魚胚胎血管生成具有較好的抑制作用，綜合毒性和活性表現，選擇甲醇提取部位進行進一步分離純化。不同濃度的甲醇洗脫溶液對斑馬魚胚胎血管生成均具有不同程度的抑制作用，其中20%甲醇和80%甲醇兩組呈濃度依賴性。為后續京大戟抗血管生成的物質基礎研究提供了參考和依據。