基于分子對接技術篩選金銀花降尿酸物質基礎

彭磊

(河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450046)

《2017年中國痛風現狀報告白皮書》指出:我國高尿酸血癥患者人數已達1.7億，且高尿酸血癥患者每年正以9.7%的年增長率發展為痛風，是不可忽視的健康警示，但是目前還未引起大家足夠的重視。此外，大量的流行病學研究數據顯示，高尿酸血癥不僅是冠心病[1]、慢性腎病[2]的獨立危險因子，而且還與糖尿病、肥胖[3-4]等有著密切的聯系。無疑，高尿酸血癥正嚴重威脅著人類健康。金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb. )的干燥花蕾或帶初開的花，其味甘，性寒，歸肺、胃、心經，具有清熱解毒、疏散風熱的作用，臨床中常用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒等癥[5]。課題組前期對金銀花進行了初步的降尿酸藥效研究，同時結合高效液相-質譜聯用技術對其有效部位進行了化學成分分析，發現金銀花發揮降尿酸藥效可能與異綠原酸B、異綠原酸A、蘆丁、綠原酸、秦皮甲素、秦皮乙素有關(結構見圖1)，但是還未得到進一步的證實。因此，本研究通過分子對接技術將上述成分與XOD進行虛擬篩選，進一步優化出對XOD抑制率較高的活性成分，并結合整體動物試驗進行降尿酸藥效驗證，通過體內外試驗相結合模型，初步闡明金銀花發揮降尿酸藥效的物質基礎，為金銀花的深入開發和高尿酸血癥的防治提供參考和依據。

圖1 金銀花中篩選的小分子化合物結構

1 材料

1.1 藥材

異綠原酸B(純度>99%，批號：20180721，四川省維克奇生物科技有限公司)；秦皮甲素(純度>98%，批號：20180616，成都德思特生物技術有限公司)；非布司他片(批號：1903710，江蘇萬邦生化醫藥集團有限責任公司)。

1.2 試劑

尿酸(UA)試劑盒(批號：190561，中生北控生物科技股份有限公司)；黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒(批號：20190629，南京建成生物工程研究所)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，批號：20170131，國藥集團化學試劑有限公司)；D-果糖(批號：3623C327，英國AMRESCO公司)。

1.3 儀器與設備

Sunrise酶標儀(瑞士 Tecan 公司)；LXJ-Ⅱ恒溫高速離心機(上海醫用分析儀器廠)；SHZ88-1型恒溫水浴箱(北京醫療設備廠)；SHIMADZU電子天平(日本島津公司)。

1.4 實驗動物

SPF級Wistar大鼠，雄性，清潔級，5周齡，體質量(180±10)g，購自鄭州大學醫學院動物實驗中心，合格證號:SCXK (豫) 2015-0002。

2 方法

2.1 分子對接試驗

2.1.1 受體處理

XOD由2個完全對稱的亞單元組成，每一個亞單元可單獨發揮催化作用，其催化中心包括1個鉬喋呤(Mo-pt)中心、1個黃素腺嘌呤二核苷酸( FAD)及2個鐵硫中心(Fe/SI，Ⅱ)。參考文獻[6]，使用pymol v.1.6.x 軟件刪除B鏈，保留FAD、Mo-pt、Fe/SI，抽取出原配體非布司他，并刪除水分子，將處理好的受體和配體分別保存為PDB 格式備用。

2.1.2 配體處理

使用ChemBio3D繪制異綠原酸B、異綠原酸A、蘆丁、秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素的三維結構，并將其保存為PDB格式備用。

2.1.3 分子對接

將“2.1.1”中處理好的受體與“2.1.2”中處理好的配體在Vina分子對接軟件下進行分子對接研究。

2.2 整體動物試驗

2.2.1 給藥劑量及溶液配備

異綠原酸B、秦皮甲素的給藥劑量均為50 mg/kg，陽性藥非布司他給藥劑量為4.8 mg/kg，上述藥物均采用0.4% CMC-Na溶解，灌胃體積為1.2 mL/100 g。

2.2.2 造模方法

參考文獻[7]采用果糖與水1∶10比例配制。

2.2.3 動物分組及給藥

SPF級Wistar大鼠50只，雄性，體質量(180±10)g，適應性飼養7 d后，按體質量隨機分為5組，每組10只。分別為正常組、模型組、非布司他組、秦皮甲素組和異綠原酸B組。正常組給予清水，其余各組均給予10%果糖水復制高尿酸血癥大鼠。非布司他組、秦皮甲素組和異綠原酸B組給藥劑量見“2.2.1”；正常及模型組給予同等體積的0.4% CMC-Na水溶液。實驗室濕度(60±10)%，溫度(25±5)℃，實驗周期為21 d。

2.2.4 血清收集與處理

動物取血前12小時禁食不禁水，并稱量體質量，于實驗第7、14、21天剪大鼠尾尖取血，待血液室溫放置至析出血清后在3 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測大鼠血清UA、XOD水平。

2.3 統計學處理

3 結果

3.1 分子對接結果

3.1.1 準確性驗證

使用chimera軟件將XOD中的原配體非布司他構象提取出來，然后利用AutoDock將配體分子對接回已處理好的受體蛋白結合位點，對接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差RMSD=0.781 ?<2 ?，較好地重復出了原受-配體結合的構象。同時，分子對接預測的非布司他對靶蛋白的結合常數Ki為280.94 nmol/L,與文獻[8]報道的生物活性處于同一數量級，表明分子對接過程所設置的參數較合理。

3.1.2 分子對接結果

非布司他與XOD的結合能為-8.94 kcal/moL，異綠原酸B、異綠原酸A、金銀花酸、綠原酸、秦皮甲素、秦皮乙素與XOD結合能分別為-12.16、-9.22、-6.41、-10.92、-10.15、-8.12 kcal/moL，其中異綠原酸B、異綠原酸A、綠原酸、秦皮甲素結合能高于非布司他，表明上述化合物與XOD有較好結合，對XOD具有較強的抑制率，可能為金銀花發揮降尿酸的物質基礎(與XOD分子對接結果及二維平面圖結果分別見表1和圖2)。

表1 金銀花小分子化合物及陽性藥與XOD分子對接結果

圖2 金銀花小分子化合物及非布司他與XOD相互作用平面圖

3.2 體內驗證結果

從分子對接部分得到異綠原酸B、異綠原酸A、綠原酸、秦皮甲素對XOD顯示很高的抑制活性，因此，本實驗初步選異綠原酸B、秦皮甲素進行體內降尿酸藥效驗證，以驗證分子對接結果的合理性。

3.2.1 各組大鼠體質量情況比較

實驗期間，各組大鼠體質量未見顯著差異(P>0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠體質量情況比較

3.2.2 各組大鼠血清UA水平比較

實驗期間，與正常組相比，模型組大鼠血清UA值在7～21 d均顯著增高(P<0.05)，說明大鼠高尿酸血癥造模持續成功；與模型組相比，在給藥第7～21天內，非布司他組、秦皮甲素組、異綠原酸B組大鼠血清UA均顯著小于模型組(P<0.05)，說明三者均具有較好的降UA藥效，結果見表3。

表3 各組大鼠血清UA變化

3.2.3 各組大鼠血清XOD水平比較

實驗期間，與正常組相比，模型組大鼠血清XOD活性在14～21 d顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，除秦皮甲素組第7天大鼠血清XOD活性無顯著差異外(P>0.05)，其余各給藥組大鼠血清XOD活性均顯著降低(P<0.05)，說明秦皮甲素、異綠原酸B發揮降尿酸藥效可能與抑制XOD活性有關，結果見表4。

表4 各組大鼠血清XOD水平比較

4 討論

目前，控制尿酸水平西藥主要分為以下三大類：1)抑制尿酸合成關鍵酶活性，即通過抑制肝臟XOD的活性來減少尿酸的生成，從而達到降尿酸藥效，如別嘌醇、非布司他；2)促進腎臟對尿酸的排泄，即通過調控腎臟尿酸轉運蛋白URAT1活性進而達到降尿酸藥效，如臨床中常用的苯溴馬隆[9]；3)促進尿酸分解成尿囊素的藥物，如拉布立酶、培格洛酶，但還未在我國境內上市。雖然上述藥物作用靶點清晰且降尿酸藥效明確，但伴隨著上述藥物的廣泛使用，大量流行病學研究顯示，長期服用以上藥物存在較嚴重的不良反應，如臨床中常出現超敏、肝損傷、心臟毒[10-12]等報道。鑒于許多現有藥物適應證限制及不良反應，導致藥物選擇受限，因此對高尿酸血癥的藥物治療提出更高的要求，研究安全、有效的降尿酸藥物勢在必行。

近年來，分子對接技術由于其具有節省研究成本且縮小藥物開發周期等優勢，已成為大規模藥物分子虛擬篩選的主要途徑和方法[13]。本次研究分子對接結果顯示，金銀花中異綠原酸B、異綠原酸A、綠原酸、秦皮甲素4種化合物對XOD的結合能大于非布司他，說明上述成分與陽性藥非布司他相比均顯示顯著的XOD抑制活性。同時，筆者還使用Pymol軟件及ligplot軟件分析觀察金銀花小分子化合物與XOD對接結果，以異綠原酸B為例，3取代咖啡酰基3-OH與Glu802 OE1形成1個氫鍵，4取代咖啡酰基C3-OH與Ser876 OC和Glu879 OE1各形成1個氫鍵，奎寧酸與Lys771 NC形成1個氫鍵，并與Leu648、Pro1076、Phe1013、Phe649、His875、Leu1014、Thr1010、Phe1009、Leu873、Ala1078、Ala1079、Phe914、Phe649之間存在疏水作用，有報道[14]顯示殘基Glu802在XOD羥基化過程中發揮重要作用，與本次研究結果一致。

此外，整體動物實驗結果表明，秦皮甲素與異綠原酸B均具有顯著的降尿酸藥效和抑制XOD活性。向小四[15]采用黃嘌呤+氧嗪酸鉀復制小鼠高尿酸血癥，連續7 d給予高劑量(200 mg/kg)、中劑量(100 mg/kg)、低劑量(50 mg/kg)劑量秦皮甲素，結果顯示三個劑量均可顯著高尿酸血癥模型小鼠的血清尿酸值，與筆者研究結果一致，進一步證實了分子對接篩選結果的合理性。本實驗不足之處是未對綠原酸和異綠原酸A進行降尿酸藥效驗證，后期課題組將對上述成分進行藥效驗證及機制研究，以豐富金銀花發揮降尿酸藥效的物質基礎。綜上，本研究初步明確了金銀花發揮降尿酸的物質基礎，同時也為金銀花的質量控制指標的選擇和降尿酸藥物的開發提供依據和參考。