基于 TLR4/IL-1β信號通路探討阿是穴刺血治療痛風性關節(jié)炎療效觀察

左政，黃培冬，王馨悅，普勇斌

(1.云南中醫(yī)藥大學，昆明 650500;2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，昆明 650021)

痛風性關節(jié)炎(GA)屬于代謝風濕病的范疇，是因嘌呤代謝障礙和(或)尿酸排泄減少、血尿酸持續(xù)升高而引起尿酸鹽結(jié)晶(monosodium urate， MSU)析出并沉積于組織或器官而表現(xiàn)一組臨床癥候群的疾病[1]。GA常累及腎臟，引起慢性間質(zhì)性腎炎和腎尿酸結(jié)石形成，臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥、痛風性關節(jié)炎反復發(fā)作、痛風石沉積、特征性慢性關節(jié)炎和關節(jié)畸形。急性痛風性關節(jié)炎常為首發(fā)癥狀，疼痛劇烈、反復發(fā)作，如果沒有對癥治療，病情進展后常因關節(jié)畸形引起活動功能障礙，甚至造成殘疾，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和減少生存時間。近年來隨著飲食結(jié)構的改善，高蛋白、高嘌呤食物攝入量的增加，痛風的發(fā)病率逐年增高[2]，預計在21世紀，痛風在我國將成為僅次于糖尿病的代謝性疾病[3]。因此，治療和控制該病己成為全球公共衛(wèi)生關注的熱點。眾多研究表明，Toll樣受體4/白細胞介素1β(TLR4/IL-1β)信號通路在 GA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，它與免疫應答、炎癥反應關系密切，可作為治療GA的新靶點[4-6]。前期臨床觀察表明，阿是穴刺血對 GA有較好的療效，能有效控制本病發(fā)展[7]。在此基礎上，本研究以GA患者為研究對象，采用細胞學、放射、生化等方法，探討阿是穴刺血對 TLR4/IL-1β信號通路調(diào)控作用，揭示該療法在調(diào)節(jié)GA免疫應答、阻止炎癥反應的部分分子機制，現(xiàn)報告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

所有病例均為2017年10月至2018年12月在云南中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院及昆明仁德醫(yī)院就診的 GA患者，共80例。采用區(qū)組隨機進行分組先區(qū)組(區(qū)組長度為10，80例受試者分為8個區(qū)組)，再隨機分組(按就診順序依次編號，從隨機數(shù)據(jù)表中某一位置開始連續(xù)取10個2位的隨機數(shù)，隨機數(shù)排出序號后，規(guī)定序號1～5為觀察組，6～10為對照組)，每組40例。觀察組中男33例，女 7例;年齡 24～53歲，平均(28±2)歲;病程1.1～8.7年，平均(1.9±1.7)年。對照組中男36例，女 4例;年齡 22～55歲，平均(27±2)歲;病程 1.3～9.3年，平均(2.0±1)年。兩組患者性別、年齡、病程比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準

依據(jù)美國風濕病學會 1985年修訂的 GA診斷標準[8]。①滑囊液中有特異性尿酸結(jié)晶。②痛風石經(jīng)化學方法或偏振光顯微鏡鏡檢證實含尿酸結(jié)晶。③具備下列臨床、實驗室、X線征象等12條中的6條者，急性關節(jié)炎發(fā)作＞1次;炎性反應在1 d內(nèi)達高峰;單關節(jié)炎發(fā)作;患病關節(jié)皮膚暗紅色;第一跖趾關節(jié)疼痛腫脹;單側(cè)發(fā)作累及第一跖趾關節(jié);單側(cè)發(fā)作累及跗骨關節(jié);有可疑痛風石;高尿酸血癥;X線攝片示關節(jié)非對稱性腫脹;X線攝片示骨皮質(zhì)下囊腫伴骨侵蝕;關節(jié)炎發(fā)作時關節(jié)液微生物培養(yǎng)陰性。上述①②③中，具備任何1項即可確定診斷。

1.3 納入標準

①符合GA西醫(yī)診斷標準;②實驗室檢查有高尿酸血癥;③急性起病，發(fā)病在 7 d以內(nèi)，有發(fā)熱，1個或多個關節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛的臨床癥狀，體溫＜38℃;④年齡20～55歲;⑤能夠遵從醫(yī)囑堅持治療者。

1.4 排除標準

①由慢性腎功能衰竭、腫瘤放化療治療等引起的繼發(fā)性GA者;②伴有精神病、老年性癡呆、震顫麻痹、癲癇者;③刺血部位表皮嚴重損害不能施行刺血療法者;④合并嚴重心、腦血管和造血系統(tǒng)等疾病者。

2 治療方法

2.1 觀察組

采用阿是穴刺血治療。紅腫最明顯處即“阿是穴”，選取患病關節(jié)部位充盈、青紫或怒張的絡脈或病變附近相關腧穴點刺放血。患者仰臥或坐位，裸露患病關節(jié)，行常規(guī)消毒，左手按壓穴位兩旁，使皮膚繃緊，右手拇、食、中三指持大號三棱針，用腕力迅速、準確地點刺1～3針。針刺深度約3 mm，然后迅速退出，左手同時放松，用抽氣拔罐器抽吸血液及尿酸鹽，以污血出盡為度，輕癥約2～5 mL，重癥5～10 mL。關節(jié)局部腫脹明顯者，可再在患部散刺 1～3針，使炎性滲出物及尿酸鹽排出。每周2次，連續(xù)3次為1個療程，共治療3個療程后行相關檢測，每個療程期間間隔3 d。放血后用無菌棉球和低敏透氣貼貼敷針孔處，囑患者放血部位 24 h不沾水，24 h后摘掉棉球和透氣貼。

2.2 對照組

先給雙氯芬酸鈉緩釋膠囊(四川華新制藥有限責任公司生產(chǎn)，國藥準字號H19991402)，每次50 mg，每日2次。關節(jié)腫痛控制后改服苯溴馬隆片(惠氏制藥有限責任公司生產(chǎn)，國藥準字號H109500039)，每次50 mg，每日1次。連續(xù)服藥7 d為1個療程，共服用6個療程(6周)后行相關檢測。

2.3 飲食干預

①急性發(fā)作期，患者有發(fā)熱、關節(jié)腫痛時宜絕對臥床休息，避免過度活動;②治療期間應禁食動物內(nèi)臟，限制魚類、禽類進食;③多飲堿性水以促進尿酸排泄。

3 治療效果

3.1 觀察指標

兩組患者分別在治療前后各抽取空腹靜脈血15 mL于肝素鈉抗凝管中，采血時間為早晨 8:00—9:00。流式細胞術檢測外周血C反應蛋白(CRP)、血沉(ESR)、尿酸(UA);RT-PCR檢測外周血單個核細胞(PBMCs)TLR4及 IL-1β mRNA表達水平;ELISA法檢測外周血清 IL-1β、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)的水平。

3.2 療效標準

參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[9]擬定。

臨床治愈:患者關節(jié)疼痛、腫脹等癥狀消失，關節(jié)活動正常。

顯效:患者關節(jié)疼痛、腫脹等癥狀消失，關節(jié)活動不受限。

有效:患者關節(jié)疼痛、腫脹等癥狀基本消除，關節(jié)活動輕度受限。

從上述教師們的期待的學校文化特征來看，似乎兩種文化類型更為大家所期待和向往。一種是關心人與在乎人，和諧大家庭式的文化。另一種是能夠支持和鼓勵教師成長與成功的文化。當然，學校文化類型并不是優(yōu)劣之分，而只有適合與不適合，適合的就是最好的，學校管理者也應當根據(jù)本校實際情況，營造適合的學校文化，讓教師情緒勞動表現(xiàn)更恰當、更舒展。

無效:患者關節(jié)疼痛、腫脹等癥狀無明顯減輕，關節(jié)活動受限無明顯改善。

3.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，組間比較用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3.4 治療結(jié)果

3.4.1 兩組臨床療效比較

觀察組總有效率為 87.5%，對照組為 77.5%，觀察組優(yōu)于對照組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床療效比較 [例(%)]

3.4.2 兩組治療前后血清CRP、ESR、UA水平比較

兩組治療前CRP、ESR、UA比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。兩組治療后CRP、ESR、UA較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);觀察組治療后CRP、ESR低于對照組(P＜0.05);兩組治療后UA比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 兩組治療前后血清CRP、ESR、UA水平比較 (±s)

表2 兩組治療前后血清CRP、ESR、UA水平比較 (±s)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

組別 例數(shù) 時間 CRP(mg/L) ESR(mm/h) UA/(μmol/L)觀察組 40 治療前 28.6±12.2 38.3±1.6 562.14±64.12治療后 18.5±13.11)2) 20.2±5.31)2) 423.55±63.16對照組 40 治療前 27.9±13.6 37.6±2.7 542.75±67.14治療后 24.2±2.61) 28.1±8.41) 431.17±60.841)

3.4.3 兩組治療前后PBMCs TLR-4及IL-1β mRNA表達比較

兩組治療前 PBMCs TLR-4及 IL-1β mRNA的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)，具有可比性。兩組治療后 PBMCs TLR-4及 IL-1β mRNA的表達水平較治療前顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);觀察組治療后 PBMCs TLR-4及 IL-1β mRNA的表達水平低于對照組(P＜0.05)。詳見表3。

3.4.4 兩組治療前后血清 IL-1β、IL-6、IL-8水平比較

兩組治療前血清 IL-1β、IL-6、IL-8水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。兩組治療后血清 IL-1β、IL-6、IL-8水平較治療前顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);觀察組治療后血清IL-1β、IL-6、IL-8水平低于對照組(P＜0.05)。詳見表4。

表3 兩組治療前后PBMCs TLR-4及IL-1β mRNA表達比較(±s)

表3 兩組治療前后PBMCs TLR-4及IL-1β mRNA表達比較(±s)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

組別 例數(shù) 時間 TLR-4 IL-1β觀察組 40 治療前 5.8±2.1 12.6±2.3治療后 2.6±0.71)2) 4.4±2.11)2)對照組 40 治療前 6.2±1.4 11.8±4.3治療后 4.9±6.31) 7.2±5.21)

表4 兩組治療前后血清IL-1β、IL-6、IL-8水平比較 (±s,pg/mL)

表4 兩組治療前后血清IL-1β、IL-6、IL-8水平比較 (±s,pg/mL)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

組別 例數(shù) 時間 IL-1β IL-6 IL-8觀察組 40 治療前 31.5±7.1 37.9±1.5 5.1±4.3治療后 8.6±4.21)2) 24.4±2.11)2) 1.4±3.11)2)對照組 40 治療前 30.6±5.2 38.7±4.3 5.7±1.2治療后 13.4±1.31) 7.0±2.41) 3.5±2.41)

4 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，除代謝因素外，炎癥與免疫也參與了痛風的發(fā)病，尤其是固有免疫在痛風急性炎癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[10]。Toll樣受體(toll-1ike receptors， TLRs)是模式識別受體中的一種，廣泛參與病原相關分子模式(pattern recognition receptors， PRRs)的識別及內(nèi)源性危險信號相關分子模式(danger associated molecular patterns， DAMPs)的感知，產(chǎn)生相應的炎癥及免疫應答反應。在抗感染免疫中首先被人們認識，它的重要作用在于信號的傳遞及炎癥因子的產(chǎn)生[11]。在炎癥細胞(巨噬細胞、中性粒細胞等)的表面有TLRs分布。痛風的發(fā)病與尿酸鹽晶體的沉積關系密切。研究表明，在尿酸鈉結(jié)晶誘導的關節(jié)炎中，固有免疫發(fā)揮著重要的作用[12]。尿酸鹽結(jié)晶通過TLRs組成的信號通路啟動固有免疫應答，從而引發(fā)炎癥反應。近年來有學者在痛風動物模型中研究發(fā)現(xiàn)，MSU可作為DAMPs激活TLRs，并產(chǎn)生免疫應答及炎癥反應，從而促使痛風的發(fā)生發(fā)展[13]。

中醫(yī)學認為痛風屬“濕熱痹”“歷節(jié)病”范疇，主要是由于先天稟賦不足，脾腎功能失調(diào)，復因飲食不節(jié)、勞倦、七情等，使外邪痹阻于肢體經(jīng)絡，氣血凝滯不通，濕濁流注關節(jié)而發(fā)病。目前，西醫(yī)治療GA主要有飲食控制、口服藥物及手術治療等方法，口服藥物為常用方法，臨床上急性期和慢性期用藥各不相同，急性期一般采用秋水仙堿、非甾體類抗炎藥及糖皮質(zhì)激素等治療，慢性期采用尿酸排泄藥或抑制尿酸生成藥治療，藥物治療能緩解關節(jié)腫痛等癥狀，并能降低尿酸水平，但不良反應明顯。刺血療法屬于針灸學的重要組成部分，是通過針刺放血，達到減輕或治愈疾病目的的一種療法[13-14]。其作用原理在中醫(yī)學中早有論述，如《素問·血氣形態(tài)》:“凡治病必去其血。”《素問·針解》:“宛陳則除之，出惡血也。”《素問·調(diào)經(jīng)論》:“病在脈，調(diào)之血，病在血，調(diào)之絡。”該法操作簡便，能迅速緩解關節(jié)腫痛，常常有立竿見影的療效。

西醫(yī)學認為刺血療法主要是通過神經(jīng)-血管-體液的調(diào)整，改善血液微循環(huán)狀態(tài)和血液性狀流速，通過促使血管內(nèi)血栓轉(zhuǎn)歸及改善微循環(huán)障礙等方式來恢復機體對疼痛的自我調(diào)控能力。刺血療法通過局部放血，使局部沉積的尿酸鹽隨血液排出體外，同時可以加速血液及淋巴循環(huán)，加快代謝產(chǎn)物的排泄[15]。刺血療法能快速地減輕關節(jié)腔尿酸鈉的沉積，減少炎細胞的浸潤，改善關節(jié)軟骨的超微結(jié)果，進而緩解局部癥狀[16]。刺血療法能對腧穴形成慢性刺激反饋調(diào)節(jié)體內(nèi)嘌呤代謝，促進尿尿酸的排泄同時抑制血尿酸的合成[17]。現(xiàn)代研究表明，刺絡放血可以提高紅細胞對機體的抗原-抗體復合物的免疫吸附力，使被黏附的免疫復合物中的細菌或病毒等容易被吞噬細胞吞噬，從而清除瘀積在血液循環(huán)中大量潛在的病原物質(zhì)及致病性免疫復合物，提高機體的抗病能力[18-21]。

治療后組間療效比較，觀察組總有效率明顯優(yōu)于對照組，表明阿是穴刺血治療 GA有明顯的優(yōu)勢;研究發(fā)現(xiàn)觀察組治療后CRP、ESR、IL-1β、IL-6、IL-8水平及 PBMCs TLR-4及 IL-1β mRNA的表達水平顯著下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明阿是穴刺血療法具有阻斷或降低 TLRs樣受體及信號通路上相關炎性因子的作用。其作用的機制可能是通過介導TLR4/IL-1β信號通路調(diào)控免疫應答、減少炎癥細胞的浸潤，改善局部組織壞死而發(fā)揮調(diào)節(jié)GA免疫應答、抗炎的作用。

綜上所述，TLR4/IL-1β信號通路在GA的發(fā)生、發(fā)展中起著極其重要的作用。本研究結(jié)果表明，阿是穴刺血能介導TLR4/IL-1β信號通路調(diào)控GA患者免疫應答、減少炎癥細胞的浸潤，改善局部組織壞死。此結(jié)果為阿是穴刺血治療 GA效應機制研究及臨床應用提供了理論依據(jù)，豐富了中醫(yī)針灸防治GA理論。但由于本研究為單中心研究，且研究時間及經(jīng)費有限，本研究納入的樣本量相對較小，觀察周期也較短，因此，試驗的結(jié)論向外拓展受限。另外，由于阿是穴刺血操作的特殊性，本試驗研究未實施盲法，因此，試驗的結(jié)果客觀性受限。在以后的研究過程中，可盡量使用盲法，以便提高研究質(zhì)量。