乳腺癌中CD66b陽性腫瘤相關中性粒細胞的意義

盛有璟，彭煒東，王志皓，江冬瑞， 吳 強

乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因，尤其發(fā)生復發(fā)、轉移后，病死率更高[1]。然而，目前對于乳腺癌的復發(fā)、轉移并無預測指標。中性粒細胞是人體抵御感染的第一道防線，對各種炎癥信號做出反應，在癌癥中亦是如此[2]。然而，就像巨噬細胞一樣，越來越多的證據表明，腫瘤微環(huán)境中的中性粒細胞將被“誘騙”成為促進腫瘤惡性生物學行為(包括轉移)的最佳“助手”[3]。腫瘤相關中性粒細胞(tumor associated neutrophils, TANs)在腫瘤微環(huán)境中對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著至關重要的作用。在胃癌中，TANs通過GM-CSF-PD-L1途徑，抑制T細胞的增殖和功能，促進腫瘤的進展[4]。而在肝癌細胞系中，TANs通過分泌BMP2和TGF-β，上調肝癌細胞中miR-301-3p的表達來增加其干細胞特性[5]。然而，在乳腺癌中，TANs的存在及意義尚未可知。基于此，本實驗采用免疫組化法對80例乳腺癌標本中的TANs進行檢測，探究TANs在乳腺癌中的浸潤及其與臨床病理特征的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014～2015年安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院存檔的80例乳腺癌手術切除標本。所有患者診斷標準均依照WHO(2012)乳腺腫瘤分類，患者術前均未行放、化療。患者中位年齡為45歲，其中WHO Ⅰ級9例，Ⅱ級47例，Ⅲ級24例;有淋巴結轉移者34例;有遠處轉移者27例。

1.2 試劑鼠抗人CD66b單克隆抗體(BD Pharmingen，Clone. G10F5)，小鼠/兔聚合法檢測通用型試劑盒(北京中杉金橋公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)，電荷黏附載玻片(江蘇世泰實驗器材公司)。

1.3 方法標本均經10%中性福爾馬林固定后，制作成石蠟標本后連續(xù)2～3 μm厚切片。63 ℃過夜烤片，脫蠟、透明，檸檬酸高壓抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，一抗4 ℃過夜孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精染色，脫水透明后，鏡下觀察。TCGA數(shù)據庫下載乳腺癌RNA序列，R軟件等分析數(shù)據。免疫組化染色采用SP法，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判讀CD66b陽性為可見單個細胞強染色，主要定位于細胞膜及細胞質。計數(shù)10個高倍鏡視野乳腺癌組織中浸潤的中性粒細胞數(shù)，排除壞死組織、間質組織中染色陽性細胞，及非特異性染色。以所有病例中TANs密度的平均數(shù)，作為區(qū)分高、低密度腫瘤TANs的指標。

1.5 統(tǒng)計學分析采用Graphpad軟件進行統(tǒng)計學處理。樣本率之間比較采用χ2檢驗，相關性分析應用Spearman等級相關檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌中TANs的浸潤情況在乳腺癌中，腫瘤的實質和間質中均可見CD66b陽性中性粒細胞的浸潤(圖1)。

AB

2.2 不同臨床病理特征的乳腺癌患者中TANs密度比較TANs密度與患者年齡呈負相關(P<0.05)；與病理分級呈正相關(P<0.05)；與淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)；與遠處轉移呈正相關(P<0.05)；與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(P<0.05)。與ER、PR和HER-2的表達無相關性(表1)。生存分析顯示，TANs密度與患者5年無瘤生存期呈負相關(圖2)。同時，TANs在三陰型乳腺癌中密度較高(P<0.05，表2)。

圖2 TANs的密度與患者5年無瘤生存期之間的關系

2.3 TCGA數(shù)據庫分析TANs數(shù)量與淋巴結轉移、遠處轉移的關系TCGA數(shù)據庫顯示，乳腺癌中TANs的數(shù)量與淋巴結轉移和有腫瘤遠處轉移的患者呈正相關(P均<0.05，圖3)。

表1 不同臨床病理特征的乳腺癌患者中TANs密度比較

表2 TANs的密度與乳腺癌分子分型之間的相關性

3 討論

乳腺癌遠處轉移的預測和檢測轉移成為現(xiàn)階段最大的挑戰(zhàn)之一[1]。與黑色素瘤不同，乳腺癌通常不被視為具有高度免疫原性的癌癥，但越來越多的證據表明，在一部分乳腺癌中存在豐富的免疫細胞浸潤并能影響乳腺癌患者的預后[6]。研究表明PD-1表達與乳腺癌的轉移相關[7]。2019年，F(xiàn)DA批準Atezolizumab與紫杉醇聯(lián)用，用于PD-L1陽性的局部晚期或轉移性三陰型乳腺癌治療[8]。乳腺癌免疫微環(huán)境越來越受到重視。

圖3 TCGA數(shù)據庫資料顯示，乳腺癌中TANs的數(shù)量與遠處轉移(A)、淋巴結轉移(B)的關系

目前T細胞、巨噬細胞等免疫細胞在乳腺癌中的作用已被人們發(fā)現(xiàn)、證實，但對于TANs的研究仍較少。與腫瘤相關的巨噬細胞不同，由于對TANs的研究較少，N1類和N2類TANs的分類和標志物尚未可知[9]。越來越多的研究表明，中性粒細胞與淋巴細胞在外周血中的比例(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)因其檢測容易，可以作為預后指標，并且與乳腺癌患者的總生存期和無瘤生存期相關[10]。然而，NLR對感染之類的非腫瘤因素也很敏感[11]，因此尋求乳腺癌石蠟切片中TANs的標記至關重要。髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)富含于中性粒細胞中，在結直腸癌和乳腺癌中MPO表達與預后呈負相關[12-13]。但是由于MPO是炎癥過程中吞噬作用導致的嗜中性白細胞粒細胞分泌的一種酶，所以表達MPO的中性粒細胞大多是被炎癥激活，但未被腫瘤激活。G-CSF被認為是嗜中性粒細胞發(fā)育的關鍵調節(jié)劑，有研究提出其可作為TANs的標記，盡管其表達與患者的不良預后有關，但其也影響其他基質細胞，甚至癌細胞本身[14]。因此，MPO和G-CSF是否可作為TANs的標記尚有待商榷。CD66b僅在中性粒細胞上表達，在外周血中，其作為中性粒細胞的標志物。在許多癌癥中，CD66b陽性中性粒細胞的表達與腫瘤的進展有關[15]。因此，在尚未完全可知腫瘤中中性粒細胞N1、N2的表型時，腫瘤實質中CD66b陽性中性粒細胞可以作為觀察TANs的標記。

中性粒細胞由于其中位生存期短(4～10 h)，其在腫瘤中的作用一直被忽視，但眾所周知，激活的TANs壽命將會延長[9]。最近的研究表明，在腫瘤微環(huán)境中，中性粒細胞的存活率提高，壽命甚至可以延長16 h以上[15-16]。腫瘤微環(huán)境中激活的TANs可以增強腫瘤細胞的干性、促進腫瘤細胞的轉移及耐藥[5]。Li等[17]證明TANs通過IL-17a促進結腸癌細胞的侵襲和遷移。盡管有研究表明中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)，即由中性粒細胞彈性蛋白酶和DNA等中性粒細胞酶形成的三維結構，與乳腺癌的進展有關。在小鼠模型中，炎癥過程中產生的NETs將喚醒休眠的MCF-7細胞。此外，在已經到達小鼠肺部的轉移性4T1癌細胞周圍也發(fā)現(xiàn)了這種網狀結構。NETs的形成刺激了乳腺癌細胞的體外侵襲和遷移，抑制其形成或消化NETs將抑制這些功能[18]。而TANs在乳腺癌微環(huán)境中的作用少有報道。韓婷婷等[19]在小鼠自發(fā)性乳腺癌模型中發(fā)現(xiàn)，產生IL-17的γδT細胞與TANs共同促進乳腺癌的轉移。而本組實驗中，首先觀察了乳腺癌石蠟切片中，CD66b陽性TANs的確存在于腫瘤的實質中，并且通過計算其密度，發(fā)現(xiàn)高密度TANs與淋巴結轉移、遠處轉移呈正相關(P<0.05)，且與5年無瘤生存期呈負相關(P<0.05)。隨后，通過分析TCGA數(shù)據庫中998例乳腺癌，作者發(fā)現(xiàn)TANs數(shù)量與乳腺癌的遠處及淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)，證實了本組實驗結果，提示CD66b陽性TANs在乳腺癌的轉移與復發(fā)中起重要作用。而TANs在乳腺癌的促進腫瘤作用是通過NETs還是TANs的旁分泌作用于腫瘤細胞，將成為本組實驗后續(xù)研究的重點。

綜上所述，乳腺癌中存在大量中性粒細胞的浸潤，且與腫瘤的轉移、復發(fā)相關。檢測CD66b陽性TANs的密度，有望成為預測乳腺癌轉移、復發(fā)的潛在指標。