一種改良的彈力纖維染色提高肺癌臟胸膜侵犯(VPI)的診斷率

陳杰偉，黃馬燕，劉 君，袁安琦，雷 俊，張新科，肖永波

病理醫師清晰解讀周圍型肺癌與臟層胸膜的彈力纖維關系，準確判讀腫瘤是否侵犯臟層胸膜，對制定治療方案具有重要的指導意義[1-2]；第7版TNM分類中也說明了肺胸膜侵犯(visceral pleural invasion, VPI)可以作為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)預后不良的因素[3]。已有文獻[4]報道采用特殊染色法和免疫組化法先后標記彈力纖維和腫瘤細胞，能更好的觀察腫瘤細胞與周圍胸膜之間的毗鄰關系。但這種方法耗時長，費用高，且步驟多，易掉片，為進一步節約成本和提高效率，開發一種能清晰顯示肺癌細胞與臟層胸膜彈力纖維關系的方法具有社會價值，因此本文方法在維多利亞藍染色法的基礎上進行了探索和改進，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016年4月～2019年4月中山大學腫瘤醫院存檔的100例周圍型肺癌石蠟組織(包含45例明確診斷存在肺膜侵犯的肺癌)，每例連續切2張白片；另從其中隨機抽取3例周圍型肺癌石蠟組織，每例連續切6張白片。

1.2 試劑彈力纖維染色液試劑盒購自珠海貝索公司，Weigert蘇木精、Mayer蘇木精、Harris蘇木精、核固紅，均購自Wexis公司。

1.3 方法對3例肺癌白片進行HE染色及五種方法(方法1為Elastin+VG，方法2為Elastin+Weigert+VG，方法3為Elastin+Mayer+VG，方法4為Elastin+Harris+VG，方法5為Elastin+核固紅+VG)的彈力纖維染色，具體染料及主要步驟見表1。方法1為傳統的維多利亞藍染色法，方法2、3、4、5均對彈力纖維進行Elastin浸染過夜后采用三種不同的蘇木精及核固紅進行復染，再行VG液進行染色。結果由三位病理主治醫師和一位高級職稱病理醫師進行評價并推選其中一種改良方法。為進一步證明該改良方法的有效性，對100例肺癌白片采用原方法及改良方法進行染色。在不比對原來HE切片的前提下，結果由兩位病理主治醫師直接對彈力纖維染色片進行獨立判讀。判讀結果從準確性和一致性兩個方面進行評價，采用配對χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

表1 五種不同方法的彈力纖維及背景染色的主要步驟及時間

2 結果

2.1 不同方法的對比3例肺癌采用五種不同的染色方法染色，結果顯示方法2、3、4、5均不同程度地顯示了細胞核及彈力纖維(圖1)，但方法5采用核固紅復染效果略差，而蘇木精復染細胞核的結構均能清晰可見，與組織中的彈力纖維著色對比明顯。最后四位病理醫師獨立并一致選擇Mayer蘇木精作為復染細胞核。采用Mayer蘇木精復染的改良維多利亞藍方法能達到理想的效果，彈力纖維清晰，細胞核結構明顯，腫瘤細胞與肺膜的彈力纖維關系明顯，在判讀腫瘤細胞是否侵犯肺胸膜時無需再對照HE片，工作效率明顯提高。

2.2 改良方法的準確性和一致性采用方法1維多利亞藍法和方法3 Mayer蘇木精作為復染細胞核的改良維多利亞藍法對100例肺癌白片染色后，在不比對原來HE切片的前提下，由兩位病理主治醫師直接對彈力纖維染色片進行獨立判讀。統計結果顯示，采用方法1染色的彈力纖維，兩位病理醫師盲評腫瘤細胞侵犯肺膜病例數量分別是40例及42例，準確性分別是89%和93%，一致性是89%；采用方法3染色的彈力纖維，兩位醫師判讀結果一致性達100%，侵犯肺膜例數均是45例，準確率達100%，其準確性和一致性比方法1顯著提高，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。充分體現了改良后的彈力纖維染色更能滿足臨床病理診斷需求，方便診斷的同時，也減少了漏診率。

ABCDEF

表2 兩位病理醫師判讀100例不同方法彈力纖維染色結果比較

3 討論

彈力纖維廣泛分布于身體各處，特別在肺泡壁、動脈壁和皮膚較多，內對照極為豐富，所以在行彈力纖維特殊染色時往往不需要外對照。彈力纖維染色方法有多種，目前臨床病理實驗室廣泛應用的是維多利亞藍法[5]。但該方法主要顯示彈力纖維，腫瘤細胞分布與彈力纖維的關系難以判讀，不能滿足病理診斷的要求，病理醫師在判讀腫瘤細胞是否侵犯肺胸膜時，必須結合原來HE切片的組織形態，常由于切面不同，對判讀造成困擾。而且其染色原理目前也尚未清楚，可能是彈力纖維中某些部分與Elatin染液中的間苯二酚的酚基形成氫鍵而使彈力纖維被染成藍黑色。改良Harris蘇木精和Mayer蘇木精均屬于明礬蘇木精，根據文獻報道明礬蘇木精細胞核染色后應用的任何酸性染料均比較敏感，而VG染色時使用苦味酸酸性品紅復合物可脫掉大部分蘇木精的顏色，以致細胞核形態難以辨認，在這種情況下使用鐵蘇木精(Weigert蘇木精)可抵抗苦味酸的影響而達到滿意的效果，但是本實驗過程中對比了這三種蘇木精，總體蘇木精著色效果均較好，達到診斷的的需求。作者已在日常工作中應用改良維多利亞藍方法進行彈力纖維染色，Elatin染色后進行Mayer蘇木精復染5 min，流水返藍10 min，再行VG復染，結果顯示細胞核著色比較細膩，核仁明顯，與彈力纖維的染色對比明顯，能較好地滿足病理診斷的要求，相對原來維多利亞藍方法，病理診斷的準確性有了明顯的提高。當然，彈力纖維更多更深層次的染色機制仍需要進一步探討。

綜上所述，彈力纖維在病理診斷中應用廣泛，尤其是肺癌VPI的判讀更是需要借助彈力纖維染色。本改良方法經反復的實踐驗證，結果穩定，可靠，重復性好，可以明顯減少臨床病理醫師的工作量，提高工作效率，同時也提高了肺癌VPI的準確性，值得推廣應用。