小鼠卵巢組織切片HE和Masson染色法的比較

馮梓欣，田雪梅

卵巢是雌性動物生殖系統的重要器官，卵泡是卵巢組織中的主要結構成分。卵巢長期處于動態變化中，其中卵泡受到一系列復雜精細的調控而發生形態和結構的變化，處于不同的發育階段[1]。卵泡根據形態和功能可分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡四個階段，不具備生長優勢的卵泡在發育進程中形成閉鎖卵泡[2]。對卵巢的組織學和病理學研究中，常常需要借助染色來觀察組織切片中卵泡的形態結構，識別各種發育階段的卵泡。HE、PAS、Masson染色是小鼠卵巢組織石蠟切片常用的染色方法[3]。本文比較觀察HE染色和Masson染色的卵巢組織切片，以探討這兩種染色方法在卵巢組織切片中的應用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1試劑 Bouin液：飽和苦味酸水溶液75 mL，10%中性福爾馬林25 mL，冰醋酸5 mL；Ehrlich蘇木精：取蘇木精2 g加入100 mL無水乙醇，37 ℃攪拌溶解后加入甘油100 mL，另取硫酸鋁鉀3 g加入100 mL蒸餾水，充分混勻，將上述兩種液體充分混勻后再加入10 mL冰醋酸，自然氧化成熟后過濾使用；伊紅染液：伊紅1 g，95%乙醇100 mL；1%鹽酸乙醇溶液：70%乙醇99 mL，濃鹽酸1 mL；Masson染色試劑盒購自南京建成科技公司，內含核染液(主要成分為蘇木精染液)、質染液(麗春紅、酸性復紅混合染液)、分色液(磷鉬酸水溶液)、沖洗液(乙酸水溶液)、復染液(苯胺藍染液)。

1.1.2儀器 石蠟包埋機(徠卡YB-6LF)；切片機(徠卡RM2235)；顯微鏡(尼康ECLIPSE 80i)。

1.2 小鼠卵巢石蠟切片制作小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉，頸椎脫臼法處死，取出雙側卵巢投入新鮮配制的Bouin液中固定12 h。實驗動物的操作均符合華南師范大學實驗動物倫理學管理條例。將固定后的卵巢于70%乙醇中脫去黃色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。包埋好的組織蠟塊，連續5 μm厚切片，HE染色和Masson染色分別用于相鄰切片。

1.3 HE染色切片常規脫蠟至水，Ehrlich蘇木精染色20 min，1%鹽酸乙醇分色，自來水藍化20 min，用蒸餾水洗；再經70%、80%和90%乙醇各3 min，伊紅染液10 s；95%、100%乙醇各10 min，二甲苯透明，中性樹膠封固，普通光鏡下觀察。

1.4 Masson染色染色按照試劑盒說明書中的方法進行操作。切片常規脫蠟至水，核染液染色1 min，沖洗液沖洗30 s；質染液染色10 s，沖洗液沖洗30 s；分化液分色8 min；棄去分色液后直接用復染液染色3 min，100%乙醇洗凈浮色，二甲苯透明，中性樹膠封固，普通光學顯微鏡觀察。

2 結果

初級卵泡由一個卵母細胞和外周包圍的若干層卵泡細胞組成，卵母細胞和卵泡細胞間有一層透明帶(圖1A)；次級卵泡體積增大，透明帶增厚，卵泡細胞間出現大小不等的腔隙(圖1B)。HE染色的切片中，卵巢組織中各發育階段卵泡及卵巢基質的形態結構清晰可見，細胞核呈藍紫色，細胞質及間質成分呈淺紅色，卵泡中卵母細胞、卵泡細胞、透明帶均清晰可見；Masson染色的切片中，透明帶和含有膠原蛋白的結構呈清晰的藍色，其他成分均呈橙紅色，能分辨各階段卵泡及卵巢基質，但不能清晰地顯示卵泡細胞、卵泡膜細胞和卵巢基質成分(圖1C、D)。

對兩種染色法進行觀察比較發現，HE染色的切片中表現正常的初級卵泡(圖2A)和次級卵泡(圖2B)，在Masson染色的切片中可觀察到透明帶皺縮及凹陷(圖2C、D)，該初級卵泡和次級卵泡均呈現為早期閉鎖狀態。HE染色的切片中透明帶皺縮，顯示為閉鎖的卵泡，在Masson染色的切片中可觀察到該卵泡的卵母細胞染色較深，透明帶皺縮成鋸齒狀，閉鎖狀態顯示更為明顯。

3 討論

在哺乳動物卵巢中存在不同發育階段的卵泡，大部分卵泡在發育過程中逐漸發生閉鎖，只有少部分能夠發育為成熟的卵泡。在一些卵巢組織病理變化的研究中常會計數閉鎖卵泡和非閉鎖卵泡的數量[4]。因此，需要準確的分辨閉鎖卵泡和非閉鎖卵泡。閉鎖卵泡分為早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡。早期閉鎖卵泡主要表現為透明帶皺縮和少量卵泡細胞發生凋亡；晚期閉鎖卵泡主要表現為卵母細胞明顯固縮，卵泡細胞凋亡嚴重，透明帶塌陷。Liu等[5]報道HE染色結合卵泡細胞凋亡檢測可識別晚期閉鎖卵泡，但不易識別早期閉鎖卵泡。

①A①B①C①D②A②B②C②D

常規的HE染色中，細胞核被蘇木精染成藍紫色，細胞質與其他組織結構被伊紅染成淺紅色，透明帶呈現為卵母細胞和卵泡細胞間一層均質的淺紅色結構，與其周圍結構的區分不是很明顯。Masson染色法主要用于組織中纖維成分的染色[6]，其原理是根據染料分子量大小和組織滲透性，使不同組織成分染上鮮明的顏色，分子量大的染料如苯胺藍可進入到結構松散、滲透性高的組織中。卵泡的透明帶是由顆粒物質排列成疏松的纖維狀結構，所以Masson染色中卵泡的透明帶呈藍色，與周圍染成橙紅色的組織成分形成對比，更能顯示透明帶形態的變化。因此在卵巢組織的觀察中，分別進行Masson染色和HE染色，能更好地觀察不同發育狀態的卵泡并識別早期閉鎖卵泡。