蘆丁在葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠急性結腸炎中的作用及其機制

褚旭芳，王笑楠，范秋靈，汪旭

（中國醫科大學附屬第一醫院 1.消化內科；2.腎內科，沈陽 110001）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種頑固性、慢性非特異性炎性疾病，其特征是嗜中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和肥大細胞透壁滲透引起腸道炎癥發展，最終引起黏膜破壞和潰瘍［1］。IBD包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。傳統觀念認為，潰瘍性結腸炎主要與輔助性T細胞（helper T cell，Th）2型反應相關，然而越來越多的研究表明，潰瘍性結腸炎還與由結腸黏膜中的促炎細胞因子如γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、腫瘤壞死因子-α、IL-17過量產生介導的Th1和Th17免疫應答有關［2-3］。而葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的小鼠結腸炎是與人類非常相似、研究最廣泛的動物模型［4］。蘆丁是一種大量存在于蕎麥、洋蔥、茶葉和蘋果等植物中的黃酮醇，具有抗炎、抗氧化、細胞保護、血管保護、神經保護和心臟保護等活性。目前，蘆丁主要作為血管保護劑應用于臨床。據報道，蘆丁對潰瘍性結腸炎具有一定的治療作用，但關于蘆丁和潰瘍性結腸炎的研究較少，尚未見研究報道蘆丁通過調節腸固有層T淋巴細胞（lamina propria lymphocyte，LPL）的免疫應答對結腸炎起作用。本研究通過構建DSS誘導的小鼠急性結腸炎模型，采用動物模型、流式細胞染色等方法探討蘆丁對急性結腸炎的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠（SPF級），雄性，6～8周，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養于中國醫科大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，溫度24 ℃，濕度（50±10）%，勤換墊料，喂食SPF級小鼠飼料和清潔消毒飲水。本研究經中國醫科大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 DSS誘導的小鼠急性結腸炎模型的建立和觀察

將小鼠隨機分成實驗組（n=3）和對照組（n=3）。2組小鼠均自由飲用配置的3%DSS溶液。實驗組將蘆丁按50 mg·kg-1·d-1劑量灌胃，對照組以等體積（5×10-6mL·kg-1·d-1）生理鹽水灌胃。實驗重復3次。依照COOPER等［5］的評分標準，每天稱量并記錄各組小鼠的體質量。體質量下降評分：0，無體質量下降；1，體質量下降1%～5%；2，體質量下降6%～10%；3，體質量下降11%～20%；4，體質量下降＞20%。觀察小鼠的大便性狀、便血情況。大便性狀評分：0，大便正常；2，大便松軟；4，稀便。大便隱血評分：0，正常；2，隱血陽性；4，肉眼血便。計算疾病活動指數（disease activity index，DAI），DAI=體質量下降評分+大便性狀評分+大便隱血評分。

1.3 結腸病理觀察

建模5 d后脫頸處死小鼠，取小鼠結腸近心端二分之一組織，約0.5 cm，沖洗干凈，置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃避光保存。經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、脫臘、HE染色、脫水透明封片后，在光學顯微鏡下觀察結腸組織的病理變化。根據SUN等［6］的炎癥分級標準進行評分。上皮（E）：0，黏膜組織完整；1，杯狀細胞消失；2，杯狀細胞大面積消失；3，隱窩消失；4，隱窩大面積消失。炎癥浸潤（I）：0，無炎癥浸潤；l，基底部炎癥浸潤；2，炎癥浸潤到黏膜肌層；3，黏膜肌層有大量炎癥浸潤，黏膜層增厚并伴有水腫；4，炎癥浸潤到黏膜下層。病理評分=E+I。

1.4 腸LPL的提取

取出從回盲部游離至肛門口的大腸，去除腸管上的派氏淋巴結，用PBS洗凈后將結腸組織剪碎，在補充有1%胎牛血清和5 mmol/L乙二胺四乙酸的RPMI 1640培養基中振蕩，150 r/min、37 ℃水浴20 min，重復2次。棄上清以除去上皮細胞和上皮內淋巴細胞。加入補充有20%胎牛血清的RPMI 1640、1 mL混合膠原酶（200 U/mL）和50 μL DNase-Ⅰ（10 mg/mL）振蕩，150 r/min、37 ℃水浴60 min，用20 mL注射器反復吹打50次后再次水浴30 min，吹打50次后，收集消化溶液的上清液，小心地在45%/66.6%不連續的細胞分離液梯度上分層，并在室溫下以2 000 r/min離心10 min。棄上清，加Hanks平衡鹽溶液至10 mL，振蕩，取液體與臺盼藍各10 μL計數細胞，顯微鏡下預測細胞數。

1.5 流式細胞術胞內染色檢測腸固有層中Th細胞

細胞計數后，懸浮在補充有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中。將細胞分為陰性孔和陽性孔，各200 μL，分別加入到96孔板中。陽性孔：細胞懸液200 μL+佛波酯 10 μL+離子霉素 8 μL；陰性孔：細胞懸液200 μL，吹打混勻；陽性孔和陽性孔均加入布雷菲德菌素A 4 μL，吹打混勻，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱孵育4 h。孵育結束后按照制造商（美國BD Biosciences公司）的說明進行表面抗體染色、固定、破膜、洗滌，并用細胞內抗體染色。染色后的細胞用流式細胞儀（FACSAria，美國BD Biosciences公司）檢測。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 蘆丁對DSS誘導的急性結腸炎具有保護作用

2組小鼠口服3%DSS溶液5 d后均出現腹瀉、黑便或便血和體質量減輕等結腸炎癥狀，表明小鼠急性結腸炎模型造模成功。與對照組相比，實驗組小鼠體質量損失較低，第1天（實驗組與對照組分別為104.6%±0.4%和102.8%±0.5%，P＜0.01）和第5天（實驗組與對照組分別為103.1%±0.7%和97.3%±3.1%，P＜0.05）有統計學差異。第1天后對照組的DAI高于實驗組，并于第4天出現統計學差異（實驗組與對照組分別為1.33±0.94和4.33±0.47，P＜0.05）。見圖1。

圖1 2組小鼠體質量和DAI的變化Fig.1 Changes in weight loss and disease activity index of mice in two groups

實驗組和對照組的結腸長度分別為（6.86±0.89）cm和（7.21±0.85）cm，2組比較無統計學差異（P＞0.05）。實驗組與對照組相比，結腸炎癥較輕，組織學評分顯著降低（實驗組與對照組分別為2.0±1.4和6.0±0.8，P＜0.05）。見圖2。

2.2 蘆丁改變急性結腸炎小鼠結腸LPL中的免疫細胞組成

圖2 2組小鼠結腸長度和組織病理學Fig.2 Colon length and histopathology of mice in two groups

流式細胞術結果顯示，與對照組相比，實驗組小鼠LPL中的CD4+和CD8+T淋巴細胞比例明顯降低（P＜0.05），γδT細胞絕對數和比例未見明顯變化。表明蘆丁對DSS誘導的小鼠急性結腸炎具有有效的免疫調節作用。見圖3、4。

2.3 蘆丁抑制DSS誘導的結腸炎模型中腸LPL中Th1和Th17細胞免疫應答

流式細胞術結果顯示，與對照組相比，實驗組小鼠中CD4+T細胞中Th1誘導分化的IFN-γ+細胞比例明顯降低（P＜0.05），Th17誘導分化的IL-17A+細胞比例和絕對數均明顯降低（P＜0.05），IFN-γ+IL-17A+細胞絕對數明顯降低（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

圖3 2組小鼠LPL中CD4+和CD8+ T淋巴細胞的比例和絕對數Fig.3 Proportion and absolute number of CD4+ and CD8+ T lymphocytes in LPL of mice in two groups

圖4 2組小鼠LPL中γδT細胞的比例和絕對數Fig.4 Proportion and absolute number of γδT lymphocytes in LPL of mice in two groups

圖5 2組小鼠LPL中Th1和Th17細胞的比例和絕對數Fig.5 Proportion and absolute number of Th1 and Th17 cells in LPL of mice in two groups

潰瘍性結腸炎是IBD中一種慢性腸道炎性疾病，在世界范圍內其發病率高，確切發病機制尚不明確。針對特定免疫應答組分的非甾體抗炎藥、免疫抑制劑和生物療法可有效控制潰瘍性結腸炎的癥狀，但這些治療有潛在的不良反應，如類固醇依賴和嚴重感染［7］。因此，尋求一種新的治療潰瘍性結腸炎的方法非常必要。蘆丁具備活性豐富、可用性廣、制備簡單、價格便宜和不良反應少等優點，有研究表明，蘆丁對實驗性結腸炎具有保護作用。DSS結腸炎模型由于其快速、簡單、可重復性和可控性在IBD研究中非常流行，并且與人類潰瘍性結腸炎有很多類似的癥狀和體征，包括腹瀉、血便、體質量減輕、結腸縮短和黏膜潰瘍［4，7］。因此，本研究探討了蘆丁對DSS誘導的急性結腸炎的作用及其機制，結果表明，蘆丁對DSS誘導的急性結腸炎具有保護作用。

淋巴細胞代表在初始和重復接觸抗原期間產生免疫應答所需的關鍵白細胞亞群，根據表面上B或T細胞受體的表達將其分化為B淋巴細胞和T淋巴細胞，T淋巴細胞根據其T細胞受體進一步分為αβT淋巴細胞和γδT淋巴細胞，αβT淋巴細胞進一步可分為CD4+或CD8+αβT淋巴細胞［8］。CD4+T淋巴細胞可進一步分化成Th1、Th2、Th17、調節性T細胞等細胞。在IBD的免疫病理學中，關鍵機制之一是CD4+T細胞的失衡，其主要包括表達IFN-γ的Th1細胞，分泌IL-4的Th2細胞，表達IL-17A、IL-17F的Th17細胞以及表達IL-22的Th22細胞［9］。Th1細胞參與針對細胞內病原體的免疫應答，涉及包括IBD在內的多種免疫疾病［10］。結腸炎癥的易感性與免疫系統中的Th1極化相關，在誘導腫瘤壞死因子-α和IFN-γ產生中尤其明顯［11］。IBD全基因組關聯研究［12］提示，至少有24個單核苷酸多態性與Th17調節的細胞內網絡和信號轉導相關的基因座相關，表明Th17對IBD發病機制發揮重要作用。Th17及其細胞因子IL-17A、IL-21、IL-22在活動性IBD涉及的腸黏膜中增加，并且其增加與臨床-內窺鏡評估的疾病活動性相關［13］。此外，T細胞的可塑性，特別是沿Th1-Th17和Th17-Treg軸的可塑性，在IBD腸道免疫反應的調節中起著重要作用［12］。有研究［14］表明，共享Th1標記的Th17細胞亞群可能特異性參與克羅恩病和潰瘍性結腸炎的腸道炎癥，表明腸IFN-γ+IL-17+共同產生的CD4+T細胞也可能作為疾病活動性的生物標志物。因此，本研究通過流式細胞術分析2組小鼠LPL中Th1和Th17細胞的免疫應答，研究蘆丁對DSS誘導的急性結腸炎的作用機制，結果表明，蘆丁可能通過抑制Th1和Th17的免疫應答發揮作用。

綜上所述，蘆丁可能通過抑制免疫應答在DSS誘導的急性結腸炎的發生、發展中起到重要的保護作用，其機制包括腸LPL中CD4+、CD8+T淋巴細胞和Th1和Th17細胞減少及促炎細胞因子IFN-γ和IL-17A分泌減少。本研究為蘆丁可能成為緩解IBD個體急性炎癥的新型治療方法提供了實驗依據，但更細致的作用機制還需進一步研究。本研究樣本量相對較少，且缺少相關研究與報道。因此，需要更多、更詳實的研究甚至臨床試驗來驗證蘆丁作為免疫調節劑應用于IBD的潛力。