高-低氧雙向誘導制備新生大鼠支氣管肺發育不良并發肺動脈高壓模型

邢玉嬌，衣曼，富建華，薛辛東

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院兒內科，沈陽 110004；2.加拿大曼尼托巴大學兒童醫院研究所生理系，Winnipeg R3E 3P4）

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）常見于早產兒，是一種慢性肺損傷疾病，在接受呼吸支持治療和氧暴露的超低出生體重兒（extremely low birth weight，ELBW）中，BPD發病率高達60%～83%，由于該病缺乏有效的防治手段，目前已經成為在兒童醫療費用消耗中僅次于哮喘的第二大疾病［1］。BPD的主要病理變化為肺泡發育障礙和肺微血管的發育不良，以往研究［2-5］多集中于BPD的肺泡發育障礙，近年來發現，BPD患兒合并肺動脈高 壓（pulmonary hypertension，PH）高 達25%～40%，BPD-PH患兒不僅死亡率高達14%～38%，存活患兒的生存質量也受到嚴重影響。

實驗模型是研究疾病發生機制及治療方法的基礎，目前臨床有關早產兒BPD的模型制備包括吸入高濃度氧氣、機械通氣、LPS誘導等，而其中最經典、最常用為高濃度氧（30%～100%）制備［6］，該模型雖然在臨床過程和病理改變上符合早產兒BPD，但缺乏PH的病理改變，故探討加用短暫低氧刺激來模擬臨床早產兒生后短暫血氧飽和度下降，有助于更好研究BPD-PH疾病的發生機制。本研究采用60%～13%高-低氧雙向誘導方法建立模型，并通過影像學、組織學證實所建模型符合臨床BPD-PH患兒表現。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

足月新生Sprague-Dawley大鼠，由曼尼托巴大學兒童醫院研究所動物中心提供。

1.2 分組

將大鼠隨機分為4組，每組12只，分組飼養于不同氧濃度的玻璃箱內。

1.3 模型制備方法

空氣組（A組），飼養于21% O2環境，BPD組（H組）飼養于60% O2環境，低氧組（AL組）每日23 h置于21% O2環境，1 h置于13% O2環境，BPD-PH組（HL組）每日23 h置于60% O2，1 h置于13% O2環境，A組與AL組作為對照，每日分別與H組和HL組母鼠進行交換，以保證母鼠的哺乳能力及防止氧中毒。各組按不同條件持續飼養至生后14 d。

1.4 實驗設備及試劑

1.4.1 主要儀器：動物氧箱（美國BioSpherix ProOx P110高/低氧可控氧箱），水浴箱（Thermo ScientificTMPrecisionTMwater baths），切片機（ShandonTMFinesseTM325 Manual Microtome），過缸機（Leica TP1020 半自動臺式組織脫水機），包埋機（Shandon HistoCentre 2 Embedding Center），光學顯微鏡（ZEISS Axio Lab A1；AxioCam 105 color成像系統），60℃烤箱（Techne HB-1D Hybridiser Hybridisation Oven/Incubator），心臟超聲儀［Vevo 2100 High Resolution Imaging System（Visualsonics，Canada）］，肺功能儀［Flexi-Vent Small Animal Ventilator（Scireq，Canada）］，搖床（Lab-Line Model 4631 Maxi Rotator），電子秤［TR-8102D Toploading Balances（大），METTLER TOLEDO AL104 Analytical Balance（小）］。

1.4.2 主要試劑：HE染色試劑購自美國Sigma公司，免疫組化試劑購自美國Vector Laboratories公司，彈性蛋白染色試劑購自美國Rowley Biochemical公司，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（Sigma A2547，Mouse monoclonal Anti-α Smooth Muscle Actin）。

1.5 功能測定

1.5.1 二維超聲心動圖和多普勒檢查：分別于生后7 d和14 d對各組大鼠進行體質量稱量，應用vevo 2100高分辨成像系統（VisualSonics，Toronto canada），40 MHz探頭（MS 550D）進行超聲心動圖檢查以評價肺血流動力學。異氟烷吸入麻醉誘導后，將大鼠仰臥位置于加熱的ECG板上，保持體溫并獲得心電圖數據，同時面罩持續給予適當濃度O2和異氟烷吸入維持麻醉狀態。將探頭溫和置于胸部，在胸骨旁主動脈根部短軸切面肺動脈瓣口處測量肺動脈加速時間（pulmonary arterial acceleration time，PAAT）和右心室射血時間（right ventricular ejection time，RVET）。PAAT為從肺動脈收縮開始到達到流出速度峰值的時間，RVET為從肺動脈射血開始到完成收縮期的時間。

1.5.2 肺功能測定：應用flexi-Vent小動物呼吸機（Scireq，Montreal，Quebec）測定14 d大鼠肺功能［7］。大鼠接受90 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔內注射。建立麻醉后，行頸正中氣管切開術，并在氣管內插入聚乙烯導管（1.1 mm×25 mm），用外科縫線固定導管位置。導管另一端連接到小動物呼吸機，呼氣末正壓（positive end-expiratory pressure，PEEP）維持在3 cmH2O。呼吸機根據大鼠體質量向大鼠肺部傳送10 mL/kg的潮氣量，呼吸頻率150次/min。大鼠通過導管接受不同濃度的醋甲膽堿（35 μL，3～50 mg/mL，配制成生理鹽水溶液）激發，收縮氣道平滑肌以放大模型效果，進行肺功能測定，基礎肺功能測定則僅使用等量生理鹽水。每次激發前，肺載氣量由總肺活量校準。使用機器預設的flexiVent Prime-3低頻強制振蕩程序獲得呼吸機械輸入阻抗，機器測得參數后通過阻抗校準，輸出肺氣道阻力，肺組織阻力和肺組織總體彈性等結果。

1.6 動物組織標本檢測指標

1.6.1 標本的留取及組織切片制備：生后14 d大鼠接受肺功能測定后，打開胸腔，剪開左心耳，用無菌輸液針刺入右心室，4 ℃ PBS溶液以18 cm H2O壓力進行灌洗，直至肺循環血液灌出。將左肺葉浸泡于4% PFA中固定72 h。心臟減去心房和游離大血管，沿室間隔剪下右心室壁，分別稱量右心室及左心室+室間隔的質量，計算右心室質量/（左心室質量+室間隔質量）［right ventricular/（left ventricle+ventricle septum），RV/（LV+VS）］比值。

組織浸泡于4% PFA中固 定72 h后，用Leica TP1020 半自動臺式組織脫水機，順序浸泡于70% 乙醇，80%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，二甲苯，60℃石蠟進行脫水，應用Shandon HistoCentre 2 Embedding Center包埋機對脫水后的組織進行石蠟包埋，制作蠟塊。應用ShandonTMFinesseTM325 Manual Microtome切片機，制作5 μm 組織切片。

1.6.2 HE染色及輻射狀肺泡計數（radical alveolar counts，RAC）值計數：切片脫蠟水化，應用蘇木素（Sigma HHS 16-500 mL）及 伊 紅（Sigma HT110116-500 mL）對切片進行HE染色，封片干燥后由光學顯微鏡200×采集圖像，每張切片選取10個視野，應用Emery和Mithal的方法［8］計數RAC值，并進行組間比較。

1.6.3 α-SMA免疫組化染色：組織切片脫蠟水化后浸泡于PBS中：檸檬酸鹽緩沖液煮沸30 min，室溫冷卻20 min，Avidin封閉液（Vector sp-2001）及Biotin封閉液（Vector wp-2001）封閉后4 ℃過夜孵育一抗：α-SMA（Sigma A2547，mouse monoclonal Anti-α Smooth Muscle Actin；1 ∶800封閉液稀釋）次日孵育二抗：驢抗小鼠，1 ∶400封閉液稀釋，DAB法顯色（Thermo Scientific-34002），蘇木素（Vector H-3404）復染，脫水，封片，干燥后光學顯微鏡200×采集圖像。

1.6.4 彈性蛋白特殊染色：Hart’s 彈性蛋白染色法（染劑購自Rowley Biochemical，F-397）對切片進行染色，分別經過0.25%高錳酸鉀水溶液（F-379-3）氧化，雷鎖辛-品紅（F-397-1）工作液初染，5%草酸水溶液（F-397-4）洗片，Van Gieson’s溶液（F-397-2）復染后，脫水，封片干燥后光學顯微鏡（200×）采集圖像。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 肺動脈壓力改變

各組大鼠生后14 d測定PAAT和RVET，A組、AL組、H組間RVET、PAAT及RVET/PAAT無統計學差異，HL組相較于A組，RVET延長但不顯著，PAAT明顯縮短（P＜0.05），RVET/PAAT明顯升高（P＜0.001）。見圖1、表1。

Fig.1 Two-dimensional echocardiography and doppler examination on 14 d after birth圖1 各組大鼠生后14 d二維心臟超聲多普勒結果

表1 各組RVET、PAAT及RVET/PAAT比值（，n=12）Tab.1 RVET，PAAT，and RVET/PAAT ratios of each group（，n=12）

表1 各組RVET、PAAT及RVET/PAAT比值（，n=12）Tab.1 RVET，PAAT，and RVET/PAAT ratios of each group（，n=12）

1）P＜0.05，2）P＜0.001 compared with group A.

分別測定生后7 d 時A組與HL組大鼠PAAT和RVET，并與生后14 d比較（圖2、表2），7 d 時HL組與A組各項均無統計學差異，14 d 時PAAT及RVET/PAAT出現統計學差異。

2.2 肺功能改變

圖2 A組和HL組大鼠生后7 d和14 d二維心臟超聲多普勒對比Fig.2 Comparison between HL and A groups using two-dimensional echocardiography and doppler findings from examination on 7 d and 14 d after birth

表2 生后7 d和14 d時A組與HL組間RVET、PAAT及RVET/PAAT比值（，n=12）Tab.2 RVET，PAAT，and RVET/PAAT ratios of group A and group HL on 7 d and 14 d after birth（，n=12）

表2 生后7 d和14 d時A組與HL組間RVET、PAAT及RVET/PAAT比值（，n=12）Tab.2 RVET，PAAT，and RVET/PAAT ratios of group A and group HL on 7 d and 14 d after birth（，n=12）

1）P＜0.05，2）P＜0.001 compared with group A14 d.

各組肺氣道阻力無統計學差異。HL組肺組織阻力較A組高，從Mch 12 mg/mL刺激時開始出現統計學差異（P＜0.05），隨著Mch計量增加差異更加明顯（P＜0.01）。HL組織彈性阻力從Mch 25 mg/mL刺激開始出現統計學差異（P＜0.05）。H組，AL組與A組無統計學差異。見圖3。

2.3 新生大鼠BPD-PH模型的大體變化

圖3 各組大鼠肺功能變化Fig.3 Change in the lung function in each group

表3 各組大鼠生后14 d體質量及大鼠心臟RV/（LV+S）比值（，n=12）Tab.3 Rat body weight and RV/（LV+S）ratio of each group on 14 d after birth（，n=12）

表3 各組大鼠生后14 d體質量及大鼠心臟RV/（LV+S）比值（，n=12）Tab.3 Rat body weight and RV/（LV+S）ratio of each group on 14 d after birth（，n=12）

1）P＜0.05，2）P＜0.001 compared with group A；3）P＜0.001 compaed with group H.

各組大鼠在生后14 d 時體質量情況（表3），A組與AL組無統計學差異，H組與A組相比體質量明顯下降（P＜0.05），HL組體質量與A組相比，差異更加顯著（P＜0.001），HL組與H組相比，體質量也顯著下降（P＜0.001）。RV/（LV+S）比值（表3），HL組較A組顯著增高（P＜0.001），提示發生右心室肥厚，AL組，H組與A組無統計學差異。

2.4 肺組織形態學改變（圖4）

肺組織切片HE染色后可見A組和AL組為肺泡正常發育。H組肺泡體積變大，次級分隔減少，肺間質堆積增厚，HL組表現較H組更為嚴重：肺泡數量明顯下降，肺泡大而結構簡單，次級分隔少。

各組HE切片進行RAC值計數結果顯示，A組為9.45±0.78，AL組 為9.75±0.88，H組 為7.475±1.19，HL組為6±1.68，A組與AL組無統計學差異，H組較A組差異有統計學意義（P＜0.05），RAC值明顯降低，HL組與A組比較RAC值進一步降低，差異更為顯著（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠肺組織切片HE染色 ×200Fig.4 HE staining of lung sections of the groups ×200

2.5 α-SMA表達變化

將各組肺組織切片進行α-SMA免疫組織化學染色（圖5），A組可見染成棕色的α-SMA于次級分隔即將形成處濃聚（紅色箭頭標出），肺血管壁α-SMA分布菲薄（黃色箭頭標出）。AL組表現與A組大致相同。H組可見肺泡次級分隔減少，次級分隔積聚的α-SMA也減少，但有α-SMA呈線性分布于沒有形成次級分隔的肺泡壁（紅色箭頭標出），血管壁染色較A組增多（黃色箭頭標出）。HL組表現較H組更加明顯，且肺血管腔直徑增大。

2.6 Elastin表達變化

圖5 各組大鼠肺組織切片α-SMA免疫組織化學染色 ×200Fig.5 Immunohistochemical staining of α-SMA in lung sections of the groups ×200

根據Hart’s 彈性蛋白染色法對各組肺組織切片進行特殊染色（圖6）。A組可見染成黑色的Elastin于次級分隔即將形成處呈點狀濃聚（紅色箭頭標出），肺血管壁Elastin分布菲薄（藍色箭頭標出）。AL組表現與A組大致相同。H組可見肺泡次級分隔減少，次級分隔積聚的Elastin也減少，有些濃聚處散亂如毛刷，但有Elastin呈線性分布于沒有形成次級分隔的肺泡壁（紅色箭頭標出），血管壁染色較A組增多（藍色箭頭標出）。HL組表現較H組更加明顯，且肺血管腔直徑增大。

3 討論

自從上世紀Northway提出BPD至今已50余年，隨著早產兒救治技術提高，生存率亦隨之提高，BPD的定義在幾十年間被逐漸修改完善。早產兒BPD的病因多種多樣，包括產前宮內發育遲緩，胎盤功能不良，絨毛膜羊膜炎，細菌感染，孕母高血壓/子癇前期，孕母吸煙/濫用藥物，遺傳因素等，以及生后接受機械通氣，氧療，感染，動脈導管開放，營養不良等因素［9］。

嚙齒動物和人類的肺發育分為5個階段：胚胎期，假腺管期，微管期，囊泡期，肺泡期。足月新生大鼠出生時肺處于囊泡期，類似于人類胎齡26～28周的早產兒［10］，因此大鼠模型被廣泛應用于BPD研究。目前，研究中常見構建動物BPD研究模型方法包括高氧、機械通氣、LPS誘導等，其中最常用的BPD動物模型建立方法為新生大鼠或小鼠，暴露于一定濃度的氧氣，持續幾天或幾周［6］。隨著新生兒氧療的日漸規范，以往研究者建立動物模型應用的高濃度氧（75%［11］、85%［12］、95%［13］、100%［14］）條件，目前在臨床已不多見。大鼠造模的優點在于繁殖快，廉價。高濃度氧氣使新生大鼠肺囊泡分隔形成肺泡的過程延遲，肺間質增厚，持續炎癥反應，遠端微血管發育不良［15］。這些表現與臨床上早產兒BPD類似［16］。高氧模型簡便易得，且能還原BPD的主要病理生理特點。

圖6 各組大鼠肺組織切片Hart’s染色 ×200Fig.6 Hart’s staining of elastin in lung sections of the groups ×200

臨床上已發現BPD患兒合并PH的幾率高達25%～40%，雖然長期接受氧療及機械通氣，中樞神經系統及呼吸系統發育的不完善，仍使早產兒存在血氧飽和度下降的情況，目前關于PH的動物研究模型中，低氧為主要造模手段。前期研究［17-24］發現，新生大鼠暴露于60%O214 d，大鼠出現肺發育停滯。肺泡數減少，肺泡體積增大，肺間質增厚，即表現出早產兒BPD的相關特點，但并未出現PH，因此，本研究設想，在經典的BPD造模方法（生后長期吸入高濃度氧氣）的基礎上，增加短時低氧刺激，以模擬臨床中早產兒因缺氧致血氧飽和度下降的事件，建立BPD-PH模型。

本研究中，模型組新生大鼠每日吸入60% O223 h，13% O21 h，連續14 d后進行心臟超聲檢測，發現RVET/ PAAT值明顯升高，間接說明PH出現。肺功能測定發現HL組組織阻力及彈性阻力顯著升高。肺組織切片HE染色，RAC值測定反映模型組出現BPD典型病理改變。表現出肺泡數量減少，結構簡單，次級分隔數量減少等肺發育停滯特點。肺泡次級分隔形成的關鍵成分α-SMA及彈性蛋白表達及分布均發生改變。以上結果說明，應用60%～13%高-低氧雙向誘導方法建立模型，不僅肺組織的病理變化符合經典BPD模型表現，而且通過心臟超聲和肺功能驗證，模型同時形成了PH，存在肺功能受累，與經典的模型相比，更貼近臨床早產兒BPD并發PH的表現，故更適用于該疾病相關研究。

綜上，本研究應用高-低氧雙向誘導建立BPDPH模型，經鑒定模型存在BPD及PH的典型表現，可以用于今后早產兒BPD-PH的相關研究。