維生素B2在胃癌中的作用及機制研究

周儉，唐朝亮，胡文軍△，田添

胃癌是我國最常見的胃腸道惡性腫瘤，2017 年我國胃癌發病率僅次于肺癌而居第2 位（39.78/10萬），死亡率居第3 位（25.16/10 萬）［1］。盡管外科手術、化療和靶向藥物等治療手段在胃癌的治療方面取得了一定的進展，但進展期患者的5 年生存率不足50%［2-3］。維生素B2（Vit B2）又稱核黃素，屬B 族維生素，是體內黃酶類輔基的重要組成部分。Vit B2積極參與了核苷酸的合成、DNA 甲基化和修復等生化過程，與食管癌［4-5］、結直腸癌［6］、宮頸癌［7］和乳腺癌［8］等惡性腫瘤的發生和發展密切相關。有研究顯示，血清高Vit B2 水平可降低胃癌的發病風險［9］。阿帕替尼是我國自主研發的抗腫瘤藥物，廣泛用于胃癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等惡性腫瘤的治療［10］。目前臨床上已將阿帕替尼與其他藥物或治療方法進行同步聯合，得到較單藥更好的治療效果［10-11］，但阿帕替尼與Vit B2聯合用藥對胃癌的抗腫瘤效應尚少見相關研究報道。本研究對Vit B2水平與胃癌患者臨床病理特征的關系進行分析，并探討Vit B2 協同阿帕替尼對胃癌MGC-803 細胞增殖活性和凋亡的影響，以期為胃癌的精準治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年1 月—2019 年4 月阜陽市人民醫院腫瘤科收治的胃癌患者（胃癌組）39例，其中男25例，女14例；年齡35～79歲，平均（51.4±15.8）歲，所有患者均經病理學檢查確診為胃癌，且未接受手術或放化療等治療。另擇我院體檢中心同期健康體檢者40例為對照組，其中男21例，女19 例，年齡 36～71 歲，平均（49.2±13.2）歲；2 組性別（χ2=1.093）、年齡（t=0.671）差異均無統計學意義。收集胃癌患者的臨床資料，包括病理類型、組織學分型、手術情況和既往病史等。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，且獲所有研究對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 人胃癌MGC-803細胞購自上海中國科學院細胞庫。IMDM培養基購自美國Gibco公司；Vit B2購自美國Sigam 公司；阿帕替尼購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；CCK-8 試劑盒、TRIzol 液和逆轉錄試劑盒購自瑞士Roche 公司；凋亡試劑盒購自美國BD 公司；乳酸、葡萄糖和琥珀酸脫氫酶檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。細胞培養箱、分光光度計和高速低溫離心機購自美國Thermo 公司；實時熒光定量PCR（qPCR）檢測儀購自瑞士Roche公司；流式細胞儀購自美國BD Bioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集與檢測 所有研究對象均于清晨空腹抽取靜脈血3 mL，送安徽華大醫學檢驗所進行檢測。操作步驟如下：低溫高速離心機3 000×g離心20 min，吸取血清樣本，加入Vit B2樣品處理液后置于LVK3000維生素檢測儀中，嚴格按照說明書的步驟進行操作，檢測血清Vit B2水平。

1.3.2 細胞培養和氧化磷酸化水平檢測 將液氮保存的人胃癌MGC-803細胞解凍復蘇后，接種于IMDM培養基并置于37 ℃、5%CO2培養箱中。待細胞融合度為80%～90%時，采用0.25%胰酶消化、傳代后，取對數生長期細胞用于實驗。按5×103個細胞/孔接種于96 孔板中，實驗設5 個不同濃度（0、10、25、50和100 μmol/L）Vit B2組，每組設5個復孔。經不同濃度Vit B2處理24 h后，檢測乳酸、葡萄糖、琥珀酸脫氫酶含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。實驗重復3次，取均值。

1.3.3 qPCR檢測細胞調節糖酵解途徑關鍵酶及葡萄糖轉運體1（GLUT1）mRNA表達 藥物處理24 h后收集細胞，PBS清洗 3 次。按 500 μL/孔加入 TRIzol 裂解細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄成cDNA。應用SYBR Green 試劑進行 qPCR 檢測，反應條件：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 10 s，59～62 ℃退火30 s，72 ℃延長30 s，共40 個循環；72 ℃延伸10 min。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）、丙酮酸激酶M2（PKM2）和GLUT1mRNA 表達水平。實驗重復3次，取均值。

Tab.1 The information of qPCR primers表1 qPCR引物序列

1.3.4 細胞增殖-毒性檢測實驗 取對數生長期細胞按5×103個/孔接種于96孔板中，待細胞融合度為80%～90%時，更換為含有不同藥物的培養基，將細胞分為4 組，分別為對照組、Vit B2 組（加入50 μmol/L Vit B2）、阿帕替尼組（1 μmol/L阿帕替尼）和聯合用藥組（加入50 μmol/L Vit B2 和1 μmol/L阿帕替尼），每組設5個復孔。分別于0、12、24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃、5%CO2培養箱溫育1 h，采用酶標儀（EL-10C，Biobase 公司）于450 nm 波長處測定各組光密度（OD）值。實驗重復3次，取均值。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 藥物處理24 h 后棄去培養液，預冷的PBS清洗細胞2次，加入適量胰酶消化細胞。吸除胰酶，加入預冷的PBS以重懸細胞，離心后棄去上清，加入500 μL 的1×結合緩沖液，制備單細胞懸液。分別加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 染色液，混勻后避光孵育 15 min。將離心管置于流式細胞儀（BD FACSCalibur，美國BD Bioscience公司）中，檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，取均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學處理。計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；不同時點多組間比較采用重復測量設計的方差分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組與對照組血清Vit B2水平比較 胃癌組患者血清Vit B2 水平（207.85±39.71）μg/L 顯著低于對照組（246.07±45.43）μg/L，差異有統計學意義（t=3.978，P＜0.05）。

2.2 血清Vit B2 與胃癌患者臨床病理學指標的關系 血清Vit B2 水平與TNM 分期和分化程度有關（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、吸煙史和飲酒史無關（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum vitamin B2 between the different clinicopathological characteristics表2 不同臨床病理特征患者血液Vit B2水平比較（n=39）

2.3 不同濃度Vit B2組氧化磷酸化水平比較 除0 μmol/L 與10 μmol/L Vit B2 組間差異無統計學意義外，25、50、100 μmol/L Vit B2 組葡萄糖消耗量和乳酸生成量均低于0 μmol/L Vit B2組（均P＜0.05），琥珀酸脫氫酶含量均高于0 μmol/L Vit B2 組（均P＜0.05）；50 μmol/L Vit B2組葡萄糖消耗量和乳酸生成量最低，見表3。

Tab.3 Comparison of activities of mitochondrial respiratory chain complex between five groups表3 各Vit B2組細胞氧化磷酸化指標的比較（n=5，）

Tab.3 Comparison of activities of mitochondrial respiratory chain complex between five groups表3 各Vit B2組細胞氧化磷酸化指標的比較（n=5，）

＊P＜0.05；a 與 0 μmol/L 組比較，b 與 10 μmol/L 組比較，c 與 25 μmol/L組比較，d與50 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組10 μmol/L組25 μmol/L組50 μmol/L組100 μmol/L組F葡萄糖消耗量（mmol/mg蛋白）10.17±0.84 9.86±0.71 8.74±0.78a 6.83±0.62abc 8.28±0.72abd 16.433＊乳酸生成量（mmol/mg蛋白）3.21±0.33 3.06±0.23 2.58±0.22a 2.22±0.24ab 2.78±0.32ad 10.414＊琥珀酸脫氫酶（U/mgprot）5.56±0.34 5.92±0.41 6.37±0.34a 7.53±0.44abc 6.82±0.46ab 18.516＊

2.4 不同濃度Vit B2 組細胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA水平比較 除0 μmol/L與10 μmol/L Vit B2組間差異無統計學意義外，25、50、100 μmol/L Vit B2組細胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA 水平均低于0 μmol/L Vit B2 組（均P＜0.05），且50 μmol/L Vit B2組GLUT1mRNA水平最低，見表4。

Tab.4 Comparison of relative mRNA expressions between five groups表4 各Vit B2組細胞糖酵解mRNA相對表達量的比較（n=5，）

Tab.4 Comparison of relative mRNA expressions between five groups表4 各Vit B2組細胞糖酵解mRNA相對表達量的比較（n=5，）

＊P＜0.05；a 與 0 μmol/L 組比較，b 與 10 μmol/L 組比較，c 與 25 μmol/L組比較，d與50 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組10 μmol/L組25 μmol/L組50 μmol/L組100 μmol/L組F HKⅡ1.00±0.11 0.93±0.07 0.75±0.07ab 0.56±0.06abc 0.69±0.05ab 28.603＊PKM2 1.00±0.12 0.96±0.09 0.71±0.06ab 0.51±0.06abc 0.61±0.04ab 36.965＊GLUT1 1.00±0.10 0.89±0.05 0.66±0.07ab 0.43±0.04abc 0.59±0.05abd 61.558＊

2.5 各組細胞增殖活性比較 各組細胞增殖活性均隨時間基本呈增高趨勢。0 h 和12 h 時各組間差異無統計學意義；24、48 和72 h 時，對照組、Vit B2組、阿帕替尼組和聯合用藥組胃癌細胞增殖活性依次降低，組間多重比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表5。

2.6 各組胃癌細胞凋亡率比較 對照組、Vit B2組、阿帕替尼組和聯合用藥組胃癌細胞凋亡率依次升高，組間多重比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1、2。

Tab.5 Comparison of cell proliferation activities between four groups表5 各組細胞增殖活性的比較 （n=5，OD值，）

Tab.5 Comparison of cell proliferation activities between four groups表5 各組細胞增殖活性的比較 （n=5，OD值，）

＊P＜0.05；F組間=93.270，F時間=335.300，F交互=14.590，均P＜0.05；組間比較：a與對照組比較，b與Vit B2組比較，c與阿帕替尼組比較，P＜0.05；組內比較：A與0 h比較，B與12 h比較，C與24 h比較，D與48 h比較，P＜0.05

組別對照組Vit B2組阿帕替尼組聯合用藥組F 0 h 0.33±0.03 0.35±0.03 0.31±0.03 0.31±0.03 2.037 12 h 0.42±0.04A 0.40±0.04 0.40±0.03A 0.39±0.03A 0.633 24 h 0.59±0.04AB 0.58±0.04aAB 0.55±0.04abAB 0.44±0.04abcA 15.213＊48 h 0.78±0.05ABC 0.71±0.05aABC 0.59±0.04abAB 0.48±0.04abcAB 42.765＊72 h 0.89±0.05ABCD 0.78±0.05aABC 0.68±0.04abABC 0.52±0.04abcABC 60.228＊F 160.512＊96.794＊82.086＊25.271＊

Fig.1 The apoptosis detected by flow cytometry圖1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

Fig.2 Comparison of apoptosis rate between four groups of cells圖2 4組細胞凋亡率比較

3 討論

哺乳動物腸道內的微生物可合成少量Vit B2，但機體所需的大部分Vit B2 仍需要從食物中獲得。在體內，Vit B2 主要有黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸2 種形式，為細胞氧化磷酸化反應鏈中重要的輔因子，與細胞代謝和能量供應密切相關。流行病學研究顯示，在食管癌高發地區，居民膳食Vit B2 攝入量顯著低于正常水平，且通過補充Vit B2 可顯著降低該地食管癌的發生率，提高患者的生存率［5］。此外，有研究指出，高Vit B2攝入可將胃癌的發病風險降低65%［12］。上述研究表明，Vit B2 具有潛在的抗腫瘤效應。但Vit B2在胃癌致病過程中的具體作用尚鮮見報道。本研究結果顯示，胃癌患者血清Vit B2 水平顯著低于對照組，且血清Vit B2 水平與胃癌患者的TNM 分期和分化程度相關，提示Vit B2可能在胃癌的致病過程中發揮重要作用。

正常細胞的能量供應主要以消耗葡萄糖進行有氧氧化磷酸化為主，這種方式效率高，幾乎不產生乳酸。而腫瘤細胞則明顯不同，主要以消耗葡萄糖進行糖酵解為主，同時產生大量的乳酸［13-14］。研究表明，腫瘤細胞糖酵解顯著增強，而氧化磷酸化功能則明顯降低［14-15］。HKⅡ和PKM2是腫瘤細胞的糖酵解代謝的主要限速酶，GLUT1 也是將葡萄糖轉運入腫瘤細胞的關鍵酶［16-17］。琥珀酸脫氫酶是連接氧化磷酸化和線粒體呼吸鏈的樞紐之一，可作為評價氧化磷酸化的指標。研究表明，Vit B2 缺乏可以降低肝癌HepG2 細胞氧化磷酸化水平，通過加快葡萄糖消耗和產生大量乳酸，促進肝癌細胞的增殖活性［18］。本研究結果顯示，25、50、100 μmol/L Vit B2 組葡萄糖消耗量和乳酸生成量均低于0 μmol/L Vit B2 組，琥珀酸脫氫酶含量均高于0 μmol/L Vit B2組；另外，25、50、100 μmol/L Vit B2 組細胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA 水平均低于 0 μmol/L Vit B2 組。提示補充Vit B2 可上調琥珀酸脫氫酶的活性，降低葡萄糖消耗量和乳酸生成量；且其作用機制可能與下調胃癌細胞HKⅡ、PKM2和GLUT1的表達水平有關。另外，50 μmol/L Vit B2組葡萄糖消耗量和乳酸生成量最低，且50 μmol/L Vit B2組GLUT1mRNA水平最低。故選擇50 μmol/L 維生素這一濃度進行后續實驗。

阿帕替尼通過抑制腫瘤血管生成，發揮抗腫瘤效應［10，19］。2014 年，阿帕替尼獲得國家食品藥品監督管理總局批準上市，主要用于晚期胃癌的治療。但是，單一用藥可提高機體產生抗藥性的概率，削弱藥物的療效，而合理的聯合用藥可以提高抗腫瘤的療效或減輕不良反應。目前臨床已將阿帕替尼與其他藥物聯合應用，并得到較好的治療效果［10-11，20］。本研究結果表明，單獨使用Vit B2 雖可抑制胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞凋亡，但效果不及阿帕替尼。此外，Vit B2 和阿帕替尼聯合應用可顯著抑制胃癌細胞增殖，誘導胃癌細胞凋亡，其抗腫瘤效果優于單獨使用Vit B2或阿帕替尼。

綜上所述，胃癌患者血Vit B2水平降低，且與胃癌的TNM 分期和分化程度密切相關；Vit B2 與阿帕替尼聯合用藥可提高其對胃癌的抗腫瘤效果。