一株Coniella屬真菌的分離培養鑒定及抑菌活性實驗

張志博 張亞男 張笑 劉麗菲 贠娜娜 田慧敏

摘 要：從赤芍（Paeonia lactiflora Pall）植株根部分離到一株內生真菌（編號Gen7）.該菌菌絲無色，具隔膜，分生孢子梗短或無，分生孢子橢圓形初為無色，后為棕色;根據形態學特征鑒定為Coniella屬.基于ITS的BLAST檢索表明該菌株與Coniella fragariae相似度高達99.6%以上，鑒定為草莓墊殼孢Coniella fragariae （Oudem.）B.Sutton，該菌屬于半知菌門，球殼孢目spharropsidales，球殼孢科Sphaeropsidacea墊殼孢屬Coniella，為內蒙古新記錄種，以黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen、灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea Pers和茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum （Smith） Yabuuchi et al. 為材料，研究其抑菌活性，發現Coniella fragariae （Oudem.）B.Sutton對3種指示菌有不同程度的抑制作用，平均抑菌率分別達48.2%、43.1%和24.7%，該研究結果為內生真菌分離培養鑒定提供研究提供方法，并為潛在生防菌的開發利用提供理論依據.

關鍵詞：Coniella屬真菌;培養鑒定;抑菌活性

中圖分類號：Q914.83 ?文獻標識碼：A ?文章編號：1673-260X（2020）06-0033-03

植物內生真菌是指在健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現任何癥狀的一類真菌[1]，主要為子囊菌及其無性型，少數擔子菌和接合菌.內生真菌感染植物組織，一般以菌絲存在于細胞內和細胞間，從寄主中吸收營養物質供其生長所需，同時內生真菌為寄主生長發育提供水分、礦物質元素等，二者互利互惠[2].植物內生真菌普遍存在于植物組織中，種類多，代謝物不僅能刺激植物生長發育、增強寄主的抗逆性，如抗旱、抗寒等能力[3-5]，而且能提高植物對病蟲害的抵抗力[6-10]，研究發現植物內生真菌能產生具有多種生物活性的新型化合物，如抗生素、植物生長調節劑、免疫抑制活性物質、抗腫瘤活性物質等，極有可能成為發現和生產生物活性物質的重要來源，在醫藥、農林業等領域具有潛在的應用前景.

真菌傳統的分類鑒定主要是根據產孢結構和方式、孢子的形態學特征來確定.但有些內生真菌在自然條件和人工培養條件下均以菌絲和無形態形式存在，因此給形態鑒定帶來困難，ITS即內部轉錄間隔區，是核糖體DNA（rDNA）中的非編碼轉錄間隔區，該區域基因在不同菌株間存在豐富的變異，國內外對ITS區進行序列分析技術已很常見，在真菌的分類鑒定及系統發育等研究報道很多.本文采用形態學鑒定和ITS測序法對一株內生真菌進行分離培養鑒定并對其抑菌活性進行研究.

1 材料和方法

1.1 供試材料

赤峰學院校園內赤芍（Paeonia lactiflora Pall）為材料，截取健康新鮮的芍藥側根進行內生真菌的分離.

1.2 內生菌的分離和純化

取健康芍藥植株側根用自來水沖洗干凈晾干，分別用0.1%升汞漂洗10～30s，然后用無菌水沖洗，再用75%酒精漂洗0.5～1min，最后用無菌水沖洗數次.樣品經處理完畢后，在超凈工作臺內無菌狀態下切成0.2cm薄片，切口置于PDA培養基上，每個培養皿3個樣品.置于28℃條件下黑暗培養3～7d，觀察培養材料切口處長出菌絲，挑取切口處菌落邊緣菌絲轉接到新的PDA平板上，經2～3次純化，得到純培養.

1.3 內生菌的形態鑒定

1.3.1 宏觀特征觀察法

根據內生真菌在PDA培養基上的培養特征，包括菌落正面和背面顏色、紋飾、質地以及邊緣形狀、生長速度、大小進行觀察，使用手機拍照記錄.

1.3.2 顯微觀察

挑取獲得的純培養菌絲，制成徒手切片，鏡檢觀察菌株菌絲及產孢結構，如：分生孢子梗、分生孢子形態及大小等.依據真菌分類文獻進行分類鑒定.

1.4 基于rDNA～ITS測序分子鑒定

將純培養菌絲加入液氮充分碾磨，取真菌組織約30mg，提取基因組DNA，用天根PFU PCR mix進行PCR擴增，引物ITS1F/ITS4R，對所得PCR產物進行切膠純化回收（DNA凝膠純化試劑盒，AXYGEN），使用NL4對回收DNA片段進行DNA測序.

1.5 數據處理

用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件在16S數據庫中的數據進行比對，得到比對結果，從結果中挑選出同源性較高的DNA序列，查找相似性最高的菌種，確定分離菌株的分類地位.利用軟件MEGA5.1按照最大似然法構建系統進化樹，發育樹的每個分支的統計學顯著性分析重復次數為1000次.

1.6 該菌株對幾種植物病原菌株的抑菌實驗

1.6.1 指示菌

采用植物常見病原菌，黃瓜枯萎病菌黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen 、茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum和灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea Pers菌株均來自微生物實驗室.

1.6.2 實驗方法

采用對峙培養法，在無菌操作臺上分別取指示菌定量接種，在固體培養基中，挑取內生真菌菌絲或孢子，每個樣品做3個重復.培養皿置于室溫培養，分別于培養3天、5天、9天后測定抑菌圈直徑大小，重復多次，檢測其抑菌效果.

1.6.3 抑制效果計算方法

在無菌操作臺上將三種指示菌接種于PDA培養基（d=10cm）中心，周圍接種Gen7，接種3個接種點，置于室溫24℃，培養72h后開始測量抑菌圈直徑，抑菌率=DCK～DX/DCK×100，DCK=CK菌落直徑，DX=對峙培養后尖孢鐮刀菌的菌落直徑.

2 結果與分析

2.1 Gen7菌株鑒定結果

2.1.1 形態學特征

培養特征：菌落起初白色，棉絮狀，背面呈灰白色，后期菌落會有黑棕色環形條紋，背面橘黃色，中央色深.最后整個菌落變為黑色.

顯微特征：分生孢子梗未見，產孢細胞圓柱形，無色，光滑，直徑6～9μm，分生孢子初期無色長橢圓形，單胞頂端鈍圓，無色，有的有兩油滴，孢子6～8.4μm×4～6μm.

2.1.2 基于rDNA-ITS構建系統發育分析

以Gen7所測兩條序列Gen7-1和Gen7-2的ITS基因序列在Genbank數據庫BLAST搜索，表明Gen7-1、7-2與Coniella fragariae（MH861493）相似度100%，Coniella fragariae （MG748688）相似度為99.61%，而與葡萄白腐病菌Coniella diplodiella 90.61%親緣關系較遠，與桉樹小帽殼孢菌Pilidiella eucalyptorum相似度90%，Pilidiella為Coniella同物異名，都屬于半知菌門，球殼孢目spharropsidales球殼孢科Sphaeropsidaceae.

2.1.3 Gen7鑒定結果

根據墊殼孢屬Coniella態特征的描述[11，12]結合分子鑒定結果，該菌為草莓輪紋葉斑病病原草莓墊殼菌Coniella fragariae（Oudem.）B.Sutton.

2.2 抑菌試驗結果

對Gen7菌株與黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen、茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers進行抑菌實驗，結果表明，Gen5對所測試菌均具有不同程度的抑制作用.

從表中可以看出菌株Gen7對黃瓜尖鐮孢菌平均抑菌率達48.2%，對灰葡萄孢菌最大抑菌率達43.1%，對茄科勞爾氏菌的平均抑菌率24.7%，培養一周后對鐮孢菌最大抑菌率70.6%，能明顯抑制黃瓜枯萎病菌的生長，對灰霉病菌最大抑菌率達到62.5%，能明顯抑制灰霉病的生長，而對茄科病菌抑菌率最大為24.7%，具茄科青枯病菌生長具有一定的抑制作用.

Gen7對黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum、茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea在第4天時，抑菌圈達到最大分別為48.8mm、20.7mm、40.7mm，抑制作用極強，5天后菌落直徑30mm以上，完全被抑制，生長緩慢基本停止，7天后抑菌率70%以上，完全被覆蓋.

3 討論

本研究從芍藥根部分離的一株真菌Coniella fragariae，該種存在的變形結構，常被誤定為Pilidiella屬，該種分布廣泛，是植物病原之一，可侵入植物根、莖、葉，寄主范圍較廣，同時也可腐生于動物糞便中，研究表明從鵝肺中分離出的菌株提取的化合物抑制腫瘤細胞的遷移[13].尖孢鐮刀菌、灰霉病菌和番茄青枯病菌具有很強的抑菌作用，為開發園藝植物病害生防菌提供理論依據，本研究對內生真菌僅做了分子鑒定及簡單的抑菌實驗，而內生菌發酵產物的功能還需進一步研究，為菌物資源的鑒定及安全開發提供依據.

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收稿日期：2020-04-01

基金項目：內蒙古自治區創新創業訓練項目（201810138009）

通訊作者：田慧敏（1980～），女，碩士，副教授，主要從事真菌學多樣性教學及科研工作，E-mail：tiancfxy2009@126.com