發根農桿菌與綠色木霉對玉米幼苗根系生長的影響

王禹佳 武佶 李享

摘要：發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）在促進植物根系生長方面具有重要意義，而綠色木霉（Trichoderma viride）在抑制致病菌、促進作物生長等方面效果顯著。為探討發根農桿菌和綠色木霉對玉米根系生長的影響，明確二者協同增效效果及作用機制，采用盆栽法，設置發根農桿菌與綠色木霉2類菌株單一、復合接種作為試驗組，以不施菌劑作為對照，共4組處理。測定接菌后玉米株高、莖粗、葉寬、葉綠素含量、根系指標等，探究菌劑單一處理、復合處理對玉米生長的促進效果。結果表明，菌劑復合處理與單施發根農桿菌、單施綠色木霉相比玉米生長指標明顯提高;單施發根農桿菌、綠色木霉與對照相比根系生長差異明顯，單一施加發根農桿菌、綠色木霉以及混合處理均可以顯著提高玉米植株莖粗和葉綠素含量（SPAD值），但各試驗組間均無顯著性差異。說明3種處理均能促進玉米根系生長，但復合處理對玉米根系生長促進作用優于發根農桿菌和綠色木霉單一接種，說明玉米植株根系生長過程中二者可以起到協同促進作用。

關鍵詞：發根農桿菌;木霉菌;玉米;根系;促生作用

中圖分類號： S513.01 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）15-0112-06

玉米（Zea mays L.）為禾本科玉蜀黍屬一年生單子葉植物，是典型的高產C4植物[1]，在我國農業經濟中占有重要地位[2]，因此玉米品質與產量的提高始終是研究的熱點。植物的根系是影響產量的重要器官，根系形態決定了植物獲得的土地資源，同時也是影響養分吸收的重要因素[3]，進而影響植物地上部光合作用與生長發育[4]，與作物的品質和產量息息相關。玉米作為單株生產力較強的禾谷類作物，其強大的根系是成為高產作物的重要原因之一[5]。改變玉米根系特征促進作物生長是直接且有效的方法，目前許多栽培手段都是通過直接影響作物根系來實現作物高產的[6]。2005年徐洪偉等首次利用發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染非天然寄主的單子葉植物玉米，成功培養了1種玉米新種質材料——玉米毛狀根再生植株，其根系龐大且構型復雜，有利于吸收土壤中的水分和養分，從而使玉米獲得較高產量[7]。劉愛榮等研究發現，木霉菌（Trichoderma spp.）可以促進根系發育提高作物產量，也能在一定程度上抵抗生物與非生物脅迫[8]。木霉菌主要的促生機制包括分泌類植物激素丁烯羥酸內酯以刺激作物根系伸長和活化土壤中的難溶養分磷、鐵等元素[9]。前人研究發現，木霉菌株可以顯著提高馬鞭草產量，同樣也可以促進番茄、豆類、黃瓜等農作物的生長[10]。2009年Metwally等研究證明，木霉菌可以改善洋蔥的生長參數，如鮮質量、干質量、根、莖、葉面積以及葉綠素含量等[11]。Shahid等研究發現，木霉菌處理綠豆可使其產量提高29%[12]。可見木霉菌作為一種新型的生物促生劑，在生物防治與促進植物生長方面具有廣闊的應用前景。但由于環境與植物本身的影響，木霉菌單獨使用時生存能力和定殖能力較弱[13]，木霉菌通過定殖于根系外表皮，形成無毒的植物-木霉菌共生體調節植物新陳代謝實現促進作物生長[8]。目前已經證實發根農桿菌可有效促進玉米根系生長，但前人研究多集中于單一菌種的抗病或促生方面的作用[14-20]，而兩者同時接種協同促進玉米植株生長的研究鮮有報道。本試驗以玉米為研究對象，利用發根農桿菌、綠色木霉菌單一及復合接種，探究其對玉米幼苗根系生長的影響，以及二者能否發揮協同作用促進玉米植株根系生長，以期為高效生物有機肥的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料：玉米鄭單958，由筆者所在實驗室保存。

供試菌株：綠色木霉菌（Trichoderma viride），由筆者所在實驗室保存，分離于四年生大田人參根部，該人參取自吉林省臨江市四道溝鎮崗頭村，聚合酶鏈式反應（PCR）產物送至北科生物技術有限公司進行測序，將測得序列片段于美國國家生物信息中心（NCBI）網站進行基于局部比對搜索工具（BLAST）比對，確認為綠色木霉。發根農桿菌ATCC15834，由法國國家科學院生物技術與園藝研究中心Tepter博士惠贈[7]。

供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、馬鈴薯葡萄糖（PD）培養液、LB固體培養基、LB液體培養基。

供試土壤：土壤取自梨樹試驗田，土質為黑土，經立式壓力蒸汽滅菌器于121 ℃、0.22 MPa條件下滅菌 2 h，自然冷卻備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌劑制備 發根農桿菌發酵液制備：將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的發根農桿菌ATCC15834于LB固體平板中劃線培養，置于28 ℃暗培養2 d后挑取單菌落轉入5 mL LB液體培養基中，于 26.8 ℃、166 r/min 暗培養活化24 h后，吸取0.5～1.0 mL菌液轉入50 mL LB液體培養基中，于 26.8 ℃、166 r/min 黑暗振蕩培養，反復進行3次活化，菌液在600 nm處的吸光度（D600 nm）為0.4～0.6。

綠色木霉發酵液制備：將綠色木霉接種于PDA培養基中，于28 ℃活化培養3～5 d產生綠色分生孢子，用無菌水沖洗分生孢子，使用血球計數板調節孢子濃度為5.0×108 CFU/mL，將分生孢子液按照5%的接種量轉接入裝有100 mL PD培養液的250 mL三角燒瓶，于 28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養3 d制成木霉菌發酵液，備用。

1.2.2 盆栽試驗 試驗于2019年5—7月在吉林省植物資源科學與綠色生產重點實驗室內進行，取滅菌后的試驗土裝入塑料育苗盆（規格：28 cm×25 cm），每盆裝土2 kg，加入已活化的菌液150 mL，混勻后待用。試驗設置4個處理（對照，CK;單一發根農桿菌拌土處理，T1;單一綠色木霉拌土處理，T2;50%發根農桿菌+50%綠色木霉菌混合拌土處理，T3），每個處理均設3次生物學重復。播種前于45 ℃溫水中浸泡玉米種子8 h，浸泡后種子洗凈，用濾紙吸干表面多余水分，均勻地放置于鋪有濕潤濾紙的培養皿上，保持濾紙濕潤，于28 ℃恒溫培養箱中暗培養 24 h。選取大小一致的露白玉米種子，每盆播種4穴，每穴2粒，待玉米植株2葉期時定植，每盆4株。生長期間正常澆水，使土壤基本保持濕潤狀態。

1.2.3 測定指標與方法 于玉米植株4葉1心期時測定以下指標：（1）莖粗：子葉節下1 cm處粗度，用游標卡尺測定;（2）葉寬、株高，用直尺測定;（3）葉綠素含量（SPAD值）的測定：選擇生長狀態良好且長勢一致的玉米植株，清除葉片表面塵土，每張葉片的相同位置選取6個測量點，采用 TYS-A型葉綠素測定儀測定葉片的葉綠素含量（SPAD值），記錄的數據取平均值;（4）根系形態學指標的測定：將洗凈的玉米根系放入20 cm×40 cm的根盤中置于掃描儀上，在根盤中添加高度為5～10 mm的水，使水面恰好全部沒過根系，用儀器遮光板全部覆蓋住根盤，進行根系全景掃描。待掃描完成，通過Win RHIZO圖像查看軟件，調節閾值使效果最佳，獲得如下指標：總投影面積、總根長、總根表面積、平均根系直徑、根尖數、分枝數、交叉數、總根體積等。

1.2.4 數據統計與分析 用Excel處理試驗數據、作圖，利用SPSS 22.0軟件中最小顯著差異法（least significant difference，LSD）對數據進行多重比較（P<0.05）分析。

2 結果與分析

2.1 發根農桿菌、綠色木霉菌處理對玉米地上部植物學性狀的影響

從圖1可以看出，發根農桿菌、綠色木霉單一接種、混合接種對玉米幼苗莖部和葉片發育均有促進作用。施加發根農桿菌處理（T1）的玉米植株莖粗、葉綠素含量都顯著高于對照處理（P<0.05），分別提高41.1%、88.2%（圖1-A、 圖1-D）;株高和葉寬雖與對照差異不顯著，但趨勢一致，分別提高22.6%、18.0%（圖1-C、圖1-B）。施加綠色木霉處理（T2）與對照組相比葉寬沒有顯著提高，但株高（圖1-C）、莖粗（圖1-A）、SPAD值（圖1-D）顯著提高，分別提高28.4%、42.8%、60.6%。施加發根農桿菌和綠色木霉復合處理（T3）莖粗、SPAD值與對照差異顯著，分別提高38.6%、63.7%（圖1-A、圖1-D），株高、葉寬與對照差異不顯著，但均高于對照（圖1-B。圖1-C）。

葉綠素含量反映植株光合速率跟碳水化合物累積的關系，葉綠素含量與植株對光能的利用效率呈正相關關系[21]。表1結果顯示，3種處理SPAD值均顯著高于對照組，說明施加發根農桿菌、綠色木霉、發根農桿菌和綠色木霉聯合施用處理均可促進玉米植株的光合作用，有利于化合物的積累。從莖粗來看，與CK相比試驗組對玉米幼苗橫向生長發育具有顯著的促進作用，表明3種處理均可顯著提高玉米幼苗莖部素質，進而利于提高植株健壯程度。

2.2 發根農桿菌、綠色木霉菌處理對玉米根系吸收范圍的影響

根是影響植物產量的重要器官[22]，根形態決定了植物可獲得的土地資源，好的根系形態有利于土壤養分的吸收[23]。根表面積和根總投影面積反映植物與土壤的接觸面，與根系吸收水分、養分含量和吸收能力息息相關[24]。由表2可知，與對照相比，施加發根農桿菌玉米植株總根表面積顯著增加29.6%，總投影面積比對照大但差異不顯著;施加綠色木霉玉米植株總根表面積顯著提高47.4%;施加發根農桿菌、綠色木霉復合處理比單獨施加發根農桿菌根系增長效果更好，總根表面積和總投影面積分別提高22.3%、16.5%（圖2），說明綠色木霉可能具有協助發根農桿菌發揮作用促進植株根系吸收面積增大的作用。

根長可反映根系的延伸范圍，根系的縱向擴展延伸有利于植物吸收深層土壤的水分和養分，總根體積可反映植株根系健壯程度[25]，發達而健壯的根系是作物高產的基礎。如圖3所示，與對照相比，施加發根農桿菌玉米植株的總根長、總根體積差異不顯著，分別提高34.7%、45.9%;施加綠色木霉玉米植株總根長提高74.0%，總根體積增長1.65倍，且顯著高于對照;施加發根農桿菌和綠色木霉復合處理比單獨施加發根農桿菌處理增長效果更好，總根長顯著提高43.1%，總根體積顯著提高250.4%。

結果表明，單獨施加發根農桿菌、綠色木霉和混合接種都能夠促進玉米幼苗的根系生長，增加根長、總根體積、總根表面積，促進根系橫向增粗和縱向伸長，擴大根系吸收面積范圍，其中發根農桿菌和綠色木霉復合處理效果最佳。

2.3 發根農桿菌、綠色木霉菌處理對玉米根系吸收功效的影響

根系交叉數、分枝數、根尖數反映了植物根系吸收能力的強弱[24]，而根系直徑可反映植物根系總吸收功效，與植株對土壤水分和養分的吸收能力息息相關[26]。如圖4所示，單獨施加發根農桿菌玉米和施加綠色木霉玉米植株根尖數、交叉數、分枝數、平均根系直徑與對照均無顯著性差異，但比對照高;發根農桿菌、綠色木霉復合處理玉米植株比單獨施加發根農桿菌增效更佳，根尖數、交叉數、分枝數、平均根系直徑分別增長83.8%、86.4%、67.5%、142.5%。結果表明，單一施加發根農桿菌、綠色木霉和混合接種都能夠提高植株根系吸收能力，但發根農桿菌和綠色木霉復合處理效果最佳。

3 討論

3.1 施加單一菌劑對玉米地上部生長的促進作用

木霉菌用于無病原體的土壤，會引起幼苗出苗率、株高、干質量的增加[27-28]。Samantha等分離鑒定的木霉菌株可使植物葉綠素含量增加6.8%，植物生物量增加4.5%，且植株根系顯著發育[29]，本試驗結果與之一致。結果顯示，施加發根農桿菌處理的玉米植株莖粗、葉綠素含量分別提高41.1%、88.2%，顯著高于對照組，株高和葉寬雖與對照差異不顯著，但分別提高22.6%、18.0%。施加綠色木霉處理與對照組相比，株高、莖粗、SPAD值顯著提高， 分別提高28.4%、42.8%、60.6%。說明單一施加2種菌劑均可顯著促進玉米植株地上部的生長。

3.2 施加單一菌劑對玉米根系吸收能力的促進作用

玉米根系是作物吸收水分和養分的主要器官，前人研究認為，增加玉米苗期根長，擴大根系體積、根系吸收表面積，有利于根系對營養的吸收利用[22]。Yedidia等在黃瓜播種后28 d施加木霉菌T203，使黃瓜植株根體積、植株干質量分別增加95%、80%[30]。褚長彬等研究發現，經木霉發酵液處理的綠豆插條不定根提早2 d出現，并且在根數、根長、根生物量等方面都優于對照[31]。本試驗發現，與對照相比，施加發根農桿菌總根表面積顯著增加29.6%，總投影面積、總根長、總根體積、根尖數、交叉數、分枝數、平均根系直徑均高于對照且增幅較大;施加綠色木霉玉米植株根系表面積、總根長、總根體積顯著高于對照，總投影面積、根尖數、交叉數、分枝數和平均根系直徑與對照差異不顯著但均遠高于對照，結果表明施加發根農桿菌和施加綠色木霉可以明顯促進玉米根系對水分和養分的吸收能力。

3.3 綠色木霉與發根農桿菌的協同增效作用

研究發現，施加發根農桿菌和綠色木霉復合處理與單獨施加發根農桿菌處理對玉米地上部植物學性狀的影響無顯著性差異;但對玉米根系增長的影響存在顯著性差異，復合處理總根表面積和總投影面積分別比單施發根農桿菌提高22.3%、16.5%;施加發根農桿菌和綠色木霉復合處理與施加發根農桿菌處理相比，玉米植株總根長顯著提高43.1%，總根體積顯著提高250.4%，說明綠色木霉可能具有協助發根農桿菌發揮作用增大玉米植株根系吸收面積的作用。施加發根農桿菌和綠色木霉復合處理玉米植株與施加發根農桿菌相比，玉米植株根尖數、交叉數、分枝數和平均根系直徑分別增長41.2%、87.2%、73.7%、142.5%。說明綠色木霉和發根農桿菌對玉米根系吸收功效的提高存在增效作用，其機制目前仍在研究中。

4 結論

單一施加發根農桿菌與綠色木霉可以通過提高玉米莖部素質、增大植株根系增強玉米植株健壯程度、增加作物養分吸收范圍、促進植株生長，進而實現提高作物產量的目的。

混合施加發根農桿菌和綠色木霉可以發揮協同作用促進玉米植株根系生長，且與施加單一菌劑差異明顯，說明綠色木霉對發根農桿菌存在增效作用。本試驗結果為生物有機肥的后期開發與研究提供了理論基礎，對綠色農業生產具有重要意義。

參考文獻：

[1]Zhang Z H，Zhang X，Lin Z L，et al. A large transposon insertion in the stiff1 promoter increases stalk strength in maize[J]. The Plant Cell，2020，32（1）：152-165.

[2]Chaikam V，Molenaar W，Melchinger A E，et al. Doubled haploid technology for line development in maize：technical advances and prospects[J]. Theoretical and Applied Genetics，2019，132（12）：3227-3243.

[3]張旭東，王智威，韓清芳，等. 玉米早期根系構型及其生理特性對土壤水分的響應[J]. 生態學報，2016，36（10）：2969-2977.

[4]Niu X L，Zhou H M，Wang X K，et al. Changes in root hydraulic conductance in relation to the overall growth response of maize seedlings to partial root-zone nitrogen application[J]. Agricultural Water Management，2020，229：105839.

[5]戴俊英，鄂玉江，顧慰連. 玉米根系的生長規律及其與產量關系的研究——Ⅱ.玉米根系與葉的相互作用及其與產量的關系[J]. 作物學報，1988，14（4）：310-314.

[6]Kristoffersen A，Riley H . Effects of soil compaction and moisture regime on the root and shoot growth and phosphorus uptake of barley plants growing on soils with varying phosphorus status[J]. Nutrient Cycling in Agroecosystems，2005，72（2）：135-146.

[7]徐洪偉，周曉馥，陸靜梅，等. 發根農桿菌誘導玉米毛狀根發生及再生植株[J]. 中國科學（C輯：生命科學），2005，35（6）：497-501.

[8]劉愛榮，陳雙臣，陳 凱，等. 哈茨木霉對黃瓜尖孢鐮刀菌的抑制作用和抗性相關基因表達[J]. 植物保護學報，2010，37（3）：249-254.

[9]趙 政，陳 巍，王 歡，等. 木霉微生物肥與減量化肥配施對番茄產量、品質及土壤肥力的影響[J]. 土壤學報，2018，55（5）：1243-1253.

[10]Clara L A，Alvarenga E A，Zapata P D，et al. Trichoderma spp. from Misiones，Argentina：effective fungi to promote plant growth of the regional crop Ilex paraguariensis St. Hil[J]. Mycology，2019，10（4）：210-221.

[11]Metwally R A，Al-Amri S M. Individual and interactive role of Trichoderma viride and arbuscular mycorrhizal fungi on growth and pigment content of onion plants[J]. Letters in Applied Microbiology，2020，70：79-86.

[12]Shahid S，Khan M R. Evaluation of biocontrol agents for the management of root-rot of mung bean caused by Macrophomina phaseolina[J]. Indian Phytopathology，2019，72：89-98.