疏肝和胃方對肝郁脾虛證功能性消化不良大鼠Cajal間質細胞的影響

王 敏，曾代文，，溫珠明

(1.電子科技大學醫學院，四川 成都 610054；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072)

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)是一類常見的消化道疾病，具有病程長，復發率高的特點，不僅影響患者生活質量也加大患者的醫療支出。中醫理論中，肝郁脾虛是此類疾病主要病機之一。Cajal間質細胞(interstitial cells of cajal，ICCs)是胃腸道運動的起搏、調節細胞[1]。干細胞生長因子受體(c-kit)為ICCs特異性表達蛋白，c-kit表達受損會導致平滑肌收縮障礙，影響胃腸道運動[2]。本疏肝和胃方為曾代文醫師由中醫經典方《六君子湯》、《左金丸方》加減得來，主以健脾祛濕，佐以疏肝和胃之法，在數十年臨床治療肝郁脾虛性功能性消化不良中取得了較好療效。莫沙必利為臨床治療功能性消化不良的常用藥，主要通過促進胃腸動力改善相關癥狀。本研究以多因素復合夾尾法模擬中醫病機制造肝郁脾虛證功能性消化不良大鼠模型[3]，對比莫沙必利，研究疏肝和胃方對于肝郁脾虛證FD大鼠胃腸動力、ICCs凋亡、c-kit表達的影響，揭示疏肝和胃方可能的作用機制，為后續藥物開發及臨床使用提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體重(216.9±13.7)g，均采購于成都達碩實驗動物有限公司。大鼠恒溫飼養，溫度(22±2) ℃，空氣濕度40%～60%。適應性喂養2 d后，40只大鼠采用隨機數字表分四組，即對照組、模型組、莫沙組、疏肝組各10只。

1.2 主要藥物①疏肝和胃藥液：南沙參、白術(生)、茯苓、陳皮、半夏、黃連、吳茱萸(清炒)、甘草，均由四川省人民醫院藥學部庫房采購(四川中藥飲片有限責任公司)。稱取上述藥材，第一次加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮1 h，濾過，收集濾液；再分別加以8倍量、6倍量水進行第二次、第三次煎煮，時間均為0.5 h，濾過，收集濾液。合并三次濾液，濃縮、醇沉、回收乙醇、定容，制成濃度為0.95 g/ml的藥液。②莫沙必利混懸液：精密稱取適量枸櫞酸莫沙比利分散片(成都康弘藥業集團股份有限公司，國藥準字： H20031116，批號：180418)，以蒸餾水制成濃度為0.15 mg/ml的混懸液。③半固體營養糊：奶粉8 g、CMC-Na 5 g、淀粉4 g、糖4 g、活性炭3 g依次攪拌加入150 ml蒸餾水中，混合均勻，于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 試劑與儀器Tunel試劑盒(Roche，11684817910)，C-kit 抗體(Thermo，PA5-16770)，CY3山羊抗兔抗體(GB21303)，DAPI(Servicebio，G1012)，抗熒光淬滅封片劑(Servicebio，G1401)，PBS緩沖液(Servicebio)，破膜液(Servicebio)，蛋白酶K(Servicebio)，BSA(Servicebio)；移液槍，組化筆，正置熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE C1)、成像系統(NIKON DS-U3)。

1.4 方法2019年4～6月，對照組常規喂養，其余3組采用疲勞+飲食不規律+夾尾刺激法進行造模，為期14 d。造模14 d，大鼠體重下降、毛色枯黃、大便稀溏、易受刺激即提示造模成功。實驗3～4 w為給藥期。對照組、模型組、莫沙組、疏肝組每日分別以蒸餾水、蒸餾水、莫沙必利混懸液、疏肝和胃藥液灌胃給藥進行治療，灌胃體積1 ml/100 g，每日稱重。

1.5 觀察指標

1.5.1基本情況 觀察并記錄各組大鼠日常行為學情況、排便情況以及體重變化。

1.5.2胃腸動力 測定給藥期結束后，實驗大鼠均禁食但不禁水1 d。實驗第29 d，每只大鼠灌胃2 ml半固體營養糊，30 min后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉。麻醉后迅速解剖，分離胃、小腸，進行稱重、測量，計算胃排空率、小腸推進率：胃排空率=[(胃全重-胃凈重)/灌胃量]×100%。小腸推進率=碳墨在小腸推進的距離/小腸總長度×100%。

1.5.3C-KIT、TUNEL免疫熒光雙染 胃稱重完成后，剪取大小約為0.5 cm3胃竇組織，生理鹽水清洗，石蠟切片脫蠟至水，組化筆圈選組織后滴加蛋白酶K，37 ℃孵育25 min，PBS洗滌15 min；切片加入破膜液，常溫孵育20 min，PBS洗滌；加入適量TdT、dUTP混合液(1∶9)，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌，3%BSA室溫孵育30 min；加入c-kit抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌，CY3山羊抗兔抗體(1∶300)室溫避光孵育50 min；PBS洗滌，DAPI室溫避光孵育10 min，PBS洗滌，抗熒光猝滅封片劑進行封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并進行全片掃描采集圖像。

采用Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics，Inc，Rockville，MD，USA)對切片ICCs凋亡率、 c-kit 平均光密度值(aevarage optical density，AO)進行分析：凋亡率(%)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%；AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達水平越高。

1.6 統計學方法采用SPSS 21.0對數據進行統計分析，數據表示為均數±標準差。組間數據服從正態分布時采用方差分析，非正態分布則采用Kruskal-wallisH檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本情況所有大鼠初始狀態良好，毛色光潔，行動自如。造模期間，對照組大鼠飼料消耗逐增、排便正常、毛色光潔、活動自如，體重逐漸增加；造模初始，造模大鼠掙扎尖叫，暴躁，出現打架情況，后期反抗減弱，毛色逐漸枯黃，便溏次數增多，體重逐漸下降；造模結束，造模大鼠多倦怠，蜷于籠內一角，毛色枯黃，多便溏，體重減輕。治療期間，莫沙組、疏肝組大鼠毛色逐漸恢復，飼料消耗逐漸增加；治療結束后，莫沙組、疏肝組大鼠活動自如活躍，便溏減輕，毛色多柔順光潔。體重造模2 w后，相較于對照組，模型組、莫沙組、疏肝組體重均有顯著下降(P均<0.01)，提示造模成功。實驗4 w后，模型組體重仍顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，莫沙組、疏肝組與對照組相比，體重差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠實驗期間體重變化 (g)

2.2 各組胃腸動力的比較與對照組相比，模型組胃排空率較低(P<0.01)；莫沙組、疏肝組與對照組胃排空率的差異均無統計學意義(P>0.05)；莫沙組、疏肝組胃排空率均顯著高于模型組(P<0.01)。模型組小腸推進率明顯低于對照組、莫沙組、疏肝組(均P<0.01)；莫沙組、疏肝組小腸推進率與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠胃排空率及小腸推進率比較 (%)

2.3 胃竇組織ICCs凋亡、c-kit表達情況胃竇組織中，ICCs(紅色標記)多分布于環形肌層、肌間叢、黏膜下層等部位，細胞多處突起，互相連接形成網狀結構，排列緊密(圖1a)。凋亡細胞多成聚集或散在分布于肌層邊緣及黏膜下層等部位(圖4b)。模型組c-kit陽性表達相較于對照組出現明顯下降。疏肝組、對照組c-kit表達較模型組有明顯增強，但疏肝組、莫沙組c-kit表達仍低于對照組，對照組、莫沙組、疏肝組ICCs凋亡率均顯著低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.01)。莫沙組、疏肝組ICCs凋亡率與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠胃竇組織ICCs凋亡率及c-kit AO值 (%)

圖1 各組大鼠胃竇組織TUNEL、c-kit雙重免疫組化圖(×400) a:ICCs分布及c-kit表達圖；b:ICCs凋亡圖。紅色為c-kit陽性表達的ICC細胞，綠色為凋亡細胞，黃色為凋亡的c-kit陽性ICC細胞

3 討論

在中醫理論中，功能性消化不良屬于“胃脘病”的范疇，它多發于胃，同時還與肝脾關系密切?！毒霸廊珪て⑽浮氛f到，“胃司受納，脾主運化，一運一納，化生精氣”，脾胃良好的氣機升降對于食物納受消化具有重要作用，若脾胃氣機升降失調則對食物消化能力產生影響，從而導致“痞滿”等癥狀的發生。肝主疏瀉，肝氣條達，則全身氣機暢通，能夠協助脾胃升降，從而促進脾胃的運化。肝郁氣機升降不暢，脾虛水谷運化失調，則出現“噯氣”、“痞滿”、“胃脘痛”等病征[4]。運用疏肝和胃法，對功能性消化不良取得了較好的療效[5，6]。

目前對于FD的發病機制尚不完全明確，眾多臨床及動物實驗研究表明其與胃腸功能障礙、內臟高敏感、胃酸分泌異常、幽門螺旋菌感染、腦腸肽及精神心理因素等存在相關性[7，8]。在本研究中發現，造模后的大鼠，胃排空明顯延遲、小腸推進率減弱明顯，出現嚴重胃腸動力障礙。上述癥狀在約70%的FD患者中以不同程度存在[9]。產生胃腸動力障礙普遍認為有兩方面原因，一方面為神經遞質和胃腸激素所誘導的平滑肌收縮舒張異常，另一方面則是胃腸道肌電活動異常。作為胃腸道運動的起搏以及調節細胞，ICCs能與胃腸道神經、平滑肌細胞形成神經纖維ICCs平滑肌細胞 (ENS-ICCs-SMC) 網絡，產生胃腸道運動起步的慢波電位，同時介導神經遞質產生和調節，形成腸道動力功能的基本單位[10，11]。ICCs能特異性表達c-kit，失去c-kit表達的間質細胞不能誘導產生平滑肌收縮運動[12]，此外，作為酪氨酸激酶受體(kit)家族一員，c-kit能夠編碼kit，進而參與ICCs增殖分化，調控ICCs表型表達及變化[13]。

研究發現，在胃食管反流病發生時，相關區域的ICCs陽性面積及染色強度均出現下降[14]，且下降強度與胃食管反流病嚴重程度相關[15]；糖尿病胃輕癱的發生會導致胃內ICCs超微結構受損，形態結構的受損、數量的減少，從而進一步加重胃腸動力障礙。研究人員發現，刺激骶尾神經后的大鼠c-kit表達提高，腸道運輸加快進而提高了結腸運動功能[16]；進行結腸吻合術后的大鼠，c-kit表達下降、小腸蠕動減慢，通過針灸，c-kit表達增加，促進了ICCs和腸道運動功能恢復[17]。

在FD的中醫藥基礎以及臨床現代研究中發現，半夏瀉心湯對于腸道功能具有雙相調節作用，能夠增加FD大鼠ICCs數量[18]，修復受損ICCs超微結構[19]；健脾疏肝和胃方可通過上調ICCs表達，提高胃排空率對FD進行治療[20]，疏肝理氣法可能通過下調Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caapase9，上調Bcl-2、PI3K、PDK1、Akt等蛋白表達對PI3K/PDK1/Akt信號通路進行調控，從而減少由陽明腑實證引起的胃ICCs凋亡[21]；養陰潤腸湯能夠通過恢復SCF/c-kit通路，進而提高慢傳輸性便秘大鼠的ICC數量和表達，改善相應癥狀[22]；運用電針治療，能顯著增加肝郁脾虛FD大鼠胃電波節律和胃竇組織ICC表達[23]。

通過本研究發現，模型組大鼠ICCs凋亡明顯、c-kit表達減弱，出現明顯的胃腸動力障礙，疏肝和胃方能顯著緩解模型大鼠ICCs凋亡、在一定程度上恢復c-kit表達，改善模型大鼠胃腸動力。對于模型大鼠出現的情志不條、行為倦怠等基本情況也有一定改善?？赡艿靡嬗诒痉姜毺氐氖韪魏臀钢?，“肝主情志”、“胃不和則臥不安”，肝氣條達脾胃調和則情志舒緩。

綜上所述，本疏肝和胃方對于肝郁脾虛證功能性消化不良大鼠出現的胃腸動力障礙有一定治療作用，可能的機制為在一定程度上上調c-kit表達、促進凋亡ICCs的恢復。本研究實驗結果顯示，造模后的大鼠ICCs凋亡嚴重，c-kit表達發生明顯下降，進而出現相應的胃腸動力障礙。