食管鱗癌根治術患者組織中CD8+/FOXP3+比值及PD-L1表達與預后的相關性

李偉民

(河南省鶴壁市人民醫院心胸外科，河南 鶴壁 458030)

食管癌是常見的發生于食管上皮組織的惡性腫瘤，其發病率與死亡率僅次于胃癌、肺癌及肝癌，位居惡性腫瘤第四位[1]。食管鱗癌是食管癌的主要病理類型，約占我國食管癌患者的90%以上，早期食管鱗癌病程較長，癥狀不明顯，不易被發現，臨床主要采用手術治療，其5年生存率可高達90%～100%，然而一旦病情一旦進入晚期，病程不到1年，其5年生存率不超過10%[2]，且對于中晚期食管鱗癌患者尚無特效的治療方法，因此，早期、及時診斷與治療是提高食管鱗癌生存率的關鍵，需要深入了解食管鱗癌的發生、發展及疾病機制，并針對性診斷疾病至關重要[3]。隨著腫瘤分子生物學機制的研究不斷深入，信號分子在食管癌中的作用逐漸受到臨床重視，PD-L1主要表達于T 細胞、B 細胞、巨噬細胞等，在腫瘤環境下，其表達水平會上調，亦是實體瘤中表達的PD-1配體，兩者是免疫反應中發揮重要作用的協同刺激分子，能夠抑制淋巴細胞的增殖、活化，起到免疫負調控作用[4]；同時，既往相關研究證實，在多種實體瘤中，腫瘤浸潤性CD8+細胞毒T細胞與患者的生存周期及預后密切相關，而指叉頭框蛋白3(FOXP3)調節性T細胞亦能發揮重要的抑制抗腫瘤作用[5，6]，因此學者們猜測同時監測CD8+、FOXP3能夠更加準確的評估腫瘤患者預后，已有研究證實CD8+/FOXP3+比值在乳腺癌等腫瘤的表達及與臨床病理的相關性[7]。本研究探討食管鱗癌根治術患者組織中CD8+/FOXP3+比值及PD-L1表達與預后的相關性，為臨床及時、早期診療食管癌提供分子水平的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料2015年1月至2017年1月我院收治的100例食管鱗癌患者，納入標準：①經病理檢查證實食管鱗癌；②行根治術治療；③術前未接受放療、化療及免疫治療；④預計生存期>3月；⑤能夠完成預后隨訪；⑥經醫院倫理委員會批準，患者及家屬同意將標本用于本研究。排除標準：①手術禁忌證；②臟器癌患者；③血液系統疾病；④凝血功能障礙；⑤感染性疾病；⑥合并其它腫瘤；⑦自身免疫疾病及全身疾病；⑧心、肝、腎等重要器官嚴重功能不全或障礙；⑨精神或意識障礙。其中男65例，女35例；年齡35～73歲[(55.96±6.25)歲]；病變位于中上段46例，位于下段53例；高分化30例，中分化39例，低分化31例；TNM分期：T1～260例，T3～440例；N063例，N1～337例；M090例，M110例。

1.2 方法

1.2.1樣本來源 術中取得癌或癌旁組織1小塊，以生理鹽水及PBS沖洗血跡后置入凍存管液氮速凍，后于-80 ℃低溫保存。

1.2.2試劑 免疫組織化學SP試劑盒、免抗人CD8單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術公司)、免抗人FOXP3單克隆抗體(英國Abcam公司)、免抗人PD-L1單克隆抗體(英國Abcam公司)、抗原修復液(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.2.3檢測方法 采用SP免疫組織化學染色法檢測CD8+、FOXP3+及PD-L1，石蠟包埋組織4 μm厚連續切片，臨用前常規63 ℃烤爐烤1 h，二甲苯、乙醇以及80%～90%酒精浸泡，以封閉內源性過氧化物酶活性。微波枸櫞酸鹽抗原修復，降至室溫水洗后PBS洗3次，5 min/次，滴加阻斷劑，置于室溫下15 min。加一抗(工作濃度1∶600)4 ℃孵育24 h，PBS洗3次，1 min/次；滴加生物素標記二抗，室溫孵育30 min，PBS洗3次，3 min/次，滴加S-P試劑并37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染、脫水、干燥、中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.4陽性標準[8]PD-L1陽性主要定位于細胞膜或細胞質，以棕黃色、棕褐色為表達陽性，根據染色強度及陽性細胞率進行半定量分析，每張免疫組化切片隨機選擇5個具有代表性的高倍視野(×400)進行評估，無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；陽性細胞率≤5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。上述兩項積分相加，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

CD8陽性主要定位于細胞膜，FOXP3陽性主要定位于細胞核，以棕黃色、棕褐色為表達陽性，隨機選取間質、癌巢中5個具有代表性的高倍視野(×400)計數陽性細胞，求取CD8+/FOXP3+比值，以中位數為界限，高于中位數為高比值，低于中位數為低比值。

1.2.5隨訪 術后采用電話隨訪或門診隨訪的形式進行為期2年的隨訪，每個月隨訪一次，以隨訪終點或患者死亡為隨訪截止時間，分析所有患者的生存情況。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗；計量資料符合正態分布且方差齊，組間比較采用t檢驗，若不符合則采用秩和檢驗；相關性采用Pearson相關性分析；影響因素分析采用Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD8+、FOXP3及PD-L1表達情況CD8陽性主要定位于細胞膜，FOXP3陽性主要定位于細胞核，PD-L1陽性主要定位于細胞膜或細胞質，以棕黃色、棕褐色為表達陽性，100例患者中，58例PD-L1表達陽性，陽性表達率58.00%(58/100)；54例CD8+/FOXP3+為高比值，占54.000%(54/100)。

2.2 PD-L1陽性組與陰性組臨床特征比較兩組性別、年齡、TNM分期比較，差異無統計學意義(P>0.05)，陽性組腫瘤直徑大于陰性組(P<0.05)，見表1。

表1 PD-L1陽性組與陰性組臨床特征比較

2.3 CD8+/FOXP3+高比值與低比值組臨床特征比較兩組性別、年齡、TNM分期比較，差異無統計學意義(P>0.05)，高比值組腫瘤直徑小于低比值組(P<0.05)，見表2。

表2 CD8+/FOXP3+高比值與低比值組臨床特征比較

2.4 食管鱗癌組織PD-L1表達與CD8+、FOXP3+的關系PD-L1表達與CD8+呈正相關，與FOXP3呈負相關及CD8+/FOXP3+呈負相關(P<0.05)，見表3。

表3 食管鱗癌組織PD-L1表達與CD8+、FOXP3+的關系

2.5 隨訪情況截至隨訪終點，100例食管鱗癌患者全部完成隨訪，平均隨訪(22.14±3.08)月，死亡15例，存活85例。患者2年存活率85.00%(85/100)。

2.6 食管鱗癌預后的影響因素分析腫瘤長度、術后感染、PD-L1表達、CD8+/FOXP3+比值是食管鱗癌預后的影響因素，見表4。

表4 食管鱗癌預后的影響因素分析

3 討論

目前臨床主要采用以手術方式治療食管鱗癌，雖然近期療效顯著，但遠期預后并不十分理想，局部復發或遠處轉移是失敗的主要原因[8]。雖然眾多研究學者對食管鱗癌的治療做出諸多嘗試與努力，但患者的預后并未得到明顯改善，尋求新的生物標記物預測食管鱗癌患者預后，并未治療提供指導一直以來是臨床研究熱點。

隨著對腫瘤發生發展機制研究逐步深入，臨床認為免疫逃逸在腫瘤持續發展中發揮重要作用，腫瘤細胞表面缺少能夠被T細胞識別的特異性抗原、抗原提呈相關基因突變引發抗原提呈功能受損、抑制蛋白抑制T細胞功能等均是腫瘤免疫逃逸的主要發生機制[9]，而在眾多腫瘤免疫反應通路中，PD-L1介導的信號通路是其中最主要的通路之一，PD-L1與PD-1結合后能夠抑制腫瘤壞死因子、白介素因子等細胞因子，從而抑制T細胞的功能；同時，腫瘤細胞中PD-L1表達水平的上調，腫瘤環境中的PD-L1與PD-1相互作用會導致腫瘤特異性T細胞功能受到抑制[10]。既往諸多研究顯示，PD-L1表達與腫瘤患者預后相關，且PD-L1表達水平是獨立的預后預測因素，PD-L1表達陰性患者的預后明顯優于PD-L1表達陽性患者[11]，由此可猜測，在食管鱗癌中，PD-L1介導的信號通路在腫瘤的復發、轉移的發展中扮演重要角色。

腫瘤淋巴細胞浸潤被認為是機體抗腫瘤免疫反應的體現，腫瘤浸潤性細胞在腫瘤的發生發展中均具有重要作用，并且能夠預測多種腫瘤的預后。食管癌組織內浸潤細胞CD8+與干擾素-γ密切相關，腫瘤組織中CD8+浸潤T細胞越多，患者預后越佳。然后相關研究表明[12]，FOXP3+的表達決定著Treg 細胞的產生，FOXP3能夠參與Treg 細胞的激活與功能調節，亦是其發揮免疫功能的重要因素，而Treg 細胞能夠抑制CD8+浸潤T細胞的增殖，破壞T淋巴細胞亞群之間的平衡，抑制機體免疫功能[13]，由此可見，CD8+、FOXP3+在某種程度上均與免疫逃逸具有一定關系，因此兩者的比值與食管癌的發生發展及預后存在聯系。

本研究結果顯示，PD-L1陽性主要定位于細胞膜或細胞質，以棕黃色、棕褐色為表達陽性，且PD-L1陽性組的腫瘤直徑顯著大于陰性組，說明PD-L1表達與腫瘤的發生、進展具有一定關系，食管鱗癌患者的腫瘤直徑越大，其PD-L1表達陽性率越高，PD-L1與PD-1共同介導的信號通路在免疫逃逸中發揮重要作用，通過抑制相關細胞因子、PD-L1與PD-1相互結合等作用機制使得特異性T細胞免疫功能受到抑制，腫瘤惡性增殖發展，因此其病變腫瘤直徑更大。同時，本研究還表明，CD8陽性主要定位于細胞膜，FOXP3陽性主要定位于細胞核，CD8+/FOXP3+高比值組的腫瘤直徑顯著小于低比值組，FOXP3+的表達決定著Treg 細胞的產生，而Treg 細胞能夠抑制CD8+浸潤T細胞的增殖，破壞T淋巴細胞亞群之間的平衡，抑制機體免疫功能，且細胞CD8+與干擾素-γ密切相關，腫瘤組織中CD8+浸潤T細胞越多，患者預后越佳，由此可見，CD8+/FOXP3+比值越低，腫瘤患者免疫功能抑制越嚴重，腫瘤惡性增殖發展。而通過Pearson相關性分析顯示，PD-L1表達與CD8+呈顯著正相關，與FOXP3呈顯著負相關，與CD8+/FOXP3+呈顯著負相關，進一步佐證上述變化趨勢，PD-L1越高，CD8+/FOXP3+比值越低，食管鱗癌患者腫瘤更加惡性發展增殖，患者預后越差。通過食管鱗癌預后的多因素Logistic回歸分析，腫瘤長度、術后感染、PD-L1表達、CD8+/FOXP3+比值均是食管鱗癌患者預后的重要預測因素，提示食管鱗癌組織中PD-L1表達、CD8+/FOXP3+均會通過影響T細胞免疫功能，導致腫瘤惡性發展增殖，從而影響患者預后。

綜上所述，食管鱗癌患者存在PD-L1高表達，PD-L1、CD8+/FOXP3+可參與免疫逃逸，抑制T細胞免疫功能，導致腫瘤增殖發展，其表達水平與腫瘤大小具有一定關系，可作為監測食管鱗癌病情發展及預后的重要預測因子。