利用谷氨酸棒桿菌CRISPRi系統構建L-纈氨酸高產菌株

杜麗紅，熊海波，徐達，徐慶陽,2，陳寧,2*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津，300457)

谷氨酸棒狀桿菌為一種重要的工業化生產氨基酸的細胞工廠[1]，早期谷氨酸棒狀桿菌的修飾得益于隨機化學或紫外DNA的突變，雖然得到的菌株可大量積累氨基酸[2-3]，但是性狀不穩定和生長缺陷是菌株常常面臨的問題[4-5]。隨著分子生物學和全基因組測序的發展，基因編輯技術包括轉座子修飾、同源重組、靶點基因的缺失或過表達[6-8]。但是精準的基因編輯仍依賴于自殺載體系統，在編輯過程中，需要通過二次重組將載體丟失得到無質粒菌株，編輯效率低下是自殺載體系統一直存在的問題[9]。隨著CRISPR/Cas9技術的流行，依賴于該技術且應用于谷氨酸棒狀桿菌的CRISPR-Cpf1技術得到發展[10-11]，同時以pK18mobsacB為基礎進行優化得到的鏈霉素篩選系統也被提出[12]。

在氨基酸生產菌株構建中，基因缺失是改變胞內代謝流向的常用手段[13]，但是生長缺陷也是基因缺失常見的負向效應之一，因此很難分析并確定這些基因在氨基酸生產中的作用，特別是以維持細胞正常代謝生長的中間代謝物為合成前體物的氨基酸。L-纈氨酸生產菌株的選育經歷了傳統誘變到微生物發酵生產的演變[14-16]。隨著生物技術的發展，L-纈氨酸的合成及代謝途徑得到全面深入的研究，谷氨酸棒桿菌中丙酮酸是L-纈氨酸需要的唯一前體物質，同時也是進入TCA循環維持細胞正常代謝的重要中間代謝物[17]，經分子生物學修飾來保證更多的丙酮酸流向L-纈氨酸合成途徑是細胞大量積累L-纈氨酸的有效方式[18-20]。同時L-纈氨酸積累過程中需大量的NADPH來提供還原力[21]，而磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)是為細胞提供還原力的主要途徑。無論是對丙酮酸相關途徑還是對PPP途徑進行修飾，都會帶來細胞生長緩慢的問題，因此L-纈氨酸的高效積累同細胞生長之間存在著緊密的聯系。

為能探究與丙酮酸代謝和PPP途徑相關的基因在L-纈氨酸生產中的作用，找到利于L-纈氨酸積累的高效修飾靶點，本研究構建了一套應用于谷氨酸棒狀桿菌的雙質粒CRISPRi干擾技術，利用此干擾技術對部分基因進行不同程度的干擾，以細胞生長和L-纈氨酸積累為衡量指標，最終確定L-纈氨酸生產菌株構建中重要的修飾靶點，并為促進L-纈氨酸積累提供了有效的修飾方向。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的菌株及質粒如表1所示。

表1 本研究所用的菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 重組菌株的構建方法

基因ilvBNXV和pntAB的整合應用pK18mobsacB系統，所用重要引物如表2所示。

表2 實驗所用引物Table 2 Primers used in the study

1.3 重組質粒的構建

選擇雙酶切技術將質粒線性化，利用PCR技術獲得目的片段，線性載體和目的片段均得到后，利用同源重組試劑盒進行重組質粒的構建，重組體系見表3。

表3 同源重組體系Table 3 The homologous recombination system

1.4 培養基

斜面培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，玉米漿液15 mL/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO41 g/L，檸檬酸2 g/L，瓊脂粉15 g/L。

種子培養基：葡萄糖25 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米漿液15 mL/L，(NH4)2SO410 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，MnSO42 mg/L，FeSO42 mg/L，VB10.3 mg/L，VH0.2 mg/L，VB120.2 mg/L，苯酚紅2%。

搖瓶發酵培養基：葡萄糖30 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米漿液20 mL/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO430 mg/L，FeSO430 mg/L，VB10.5 mg/L，VH0.3 mg/L，VB120.2 mg/L，苯酚紅2%。

1.5 培養條件

斜面培養條件：接種環刮取保菌管中的菌液1環并劃線于斜面培養基中，將其放置于32 ℃培養箱中恒溫孵育培養20～24 h。

搖瓶種子培養：用接種環將斜面培養基中菌體輕輕刮起，轉接于提前滅菌的種子培養基，置于32 ℃搖床中振蕩培養，200 r/min，培養12～18 h。

搖瓶發酵培養：用提前滅菌的5 mL移液管吸取3 mL種子培養液，轉接于提前滅菌的發酵培養基中，繼續放于32 ℃搖床中振蕩培養，200 r/min，培養過程中以苯酚紅為指示劑，通過顏色變化來流加氨水控制pH，發酵至24 h結束發酵。

1.6 發酵參數測定方法

利用分光光度計測定新鮮發酵液600 nm處的吸光值，并以此來表征發酵過程中菌體濃度，以OD600來表示；利用高效液相分析系統測定發酵液中目的產品L-纈氨酸濃度。Agilent Cl8(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)為檢測柱，樣品利用2，4-二硝基氟苯進行衍生，流動相為體積分數為50%的乙腈與50 mmol/L的乙酸鈉水溶液，進行梯度洗脫，洗脫配比如表4，柱溫33 ℃，流動相流量1 mL/min，檢測波長360 nm。

表4 二元梯度洗脫表Table 4 A two-element system composed of acetonitrile and sodium acetate

1.7 相對轉錄水平的測定

見參考文獻[22]。

2 結果與討論

2.1 干擾質粒的構建

以質粒pECXK99E為dcas9的表達載體，以pXMJ19質粒為gRNA的表達載體，按照1.3中重組質粒構建方法構建兩個重組質粒，結果如圖1。

圖1 干擾質粒的構建Fig.1 Construction of interference plasmids

利用常規的重組質粒構建方法成功構建了pECXK99E-dcas9。在進行pXMJ19-gRNA重組質粒的構建時，選擇了3種不同的方案：(1)將pXMJ19進行單酶切并線性化，將根據靶點基因設計的20 bp識別序列分別加在引物的5’端，利用重疊PCR技術將其加入gRNA構件中，再利用同源重組技術將得到的包括gRNA、回文重疊序列、終止子和tracer RNA的目的片段與線性化質粒進行重組得到pXMJ19-gRNA質粒；(2)將pXMJ19進行雙酶切并線性化，同時將大腸桿菌CRISPRi系統中的酶切位點BSPQI引入目的片段中，將帶有BSPQI酶切位點的目的片段同線性化質粒重組，得到不帶有靶點基因識別序列重組質粒后，利用BSPQI酶將該質粒線性化，并再次經同源重組將靶點基因的識別序列同線性化質粒連接，得到最終的pXMJ19-gRNA質粒；(3)雙酶切將質粒pXMJ19線性化，將根據靶點基因設計的20 bp識別序列分別加在引物的5’端，利用重疊PCR將其加入gRNA構件中，再利用同源重組將得到的包括gRNA、回文重疊序列、終止子和tracer RNA的目的片段與線性化質粒進行重組得到質粒。3種方案中，方案二理論上為省時高效的實施手段，但是在具體操作時，將3個方案分別得到的10株轉化菌株提取質粒送至金唯智公司測序，發現方案一和方案二中均沒有成功重組的質粒，而方案三中陽性質粒的概率為80%，因此在后續工作中，選擇方案三進行pXMJ19-gRNA質粒的構建。

2.2 干擾系統的驗證

為驗證2.1中構建的干擾系統是否能夠成功發揮作用，選擇GFP為報告基因，并以gfp的非編碼鏈DNA序列為模板，分別在啟動子區域、翻譯起始區域(DNA序列中起始密碼子ATG區域)和遠離ATG 200 bp的下游區域尋找干擾靶點，構建3個gfp干擾質粒，并分別電轉入帶有pECXK99E-dcas9的菌株中。將得到的菌株進行搖瓶培養，發酵進行至12 h取樣，測定不同菌株中GFP的相對熒光強度，同時以帶有pECXK99E-dcas9和pXMJ19兩個質粒的菌株為對照組，結果如圖2。

通過結果可以看出，對gfp不同區域進行干擾時，GFP的相對熒光強度出現了明顯的差異。對gfpDNA序列的啟動子區域進行干擾時，GFP的相對熒光強度最低，對遠離ATG 200 bp的下游區域進行弱化時，同未被弱化的GFP差異較小，表明利用本研究中構建的雙質粒干擾系統對基因gfp的轉錄水平成功進行了干擾弱化，且選擇的3個干擾區域可實現對靶點基因的不同弱化水平。因此在對L-纈氨酸相關途徑進行弱化時，同樣選擇靶基因DNA序列非編碼鏈的啟動子區域、翻譯起始區域和遠離ATG 200 bp的下游區域3個位點進行靶基因的弱化表達實驗。

GP0-對照菌株; GP1-弱化gfp啟動子區域; GP2-弱化gfp翻譯起始區域; GP3-弱化gfp遠離ATG區域圖2 不同干擾方式對基因gfp相對熒光強度的影響Fig.2 Effect of different interference strategies on relative fluorescence intensity of gfp

2.3 L-纈氨酸生產菌株的構建

L-纈氨酸生物合成途徑中，唯一一個限速反應由乙酸乳酸合酶(AHAS)催化進行，但是此酶受到L-纈氨酸的反饋抑制，因此在L-纈氨酸生產菌株的構建中，首要任務是解除L-纈氨酸對AHAS的反饋抑制并進行上調表達。為獲得可初步積累L-纈氨酸的菌株，以本實驗室保存的經傳統誘變得到的L-纈氨酸生產菌株XV的基因組DNA為模板，對已經成功解除反饋抑制的AHAS編碼基因ilvBN進行擴增，利用pK18mobsacB技術，將Ptuf-ilvBNXV整合至谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032pqo位點，得到菌株A01，同時為進一步強化A01積累L-纈氨酸的能力，選擇將基因Ptuf-ilvBNXV雙拷貝至A01的Cgl1890位點，得到菌株A02。對菌株A01、A02進行搖瓶培養實驗，同時以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032為對照組，結果如圖3。

ATCC 13032-對照菌株; A01-Ptuf-ilvBNXV::pqo; A02-Ptuf-ilvBNXV::pqo Ptuf-ilvBNXV::Cgl1890圖3 不同菌株搖瓶發酵結果Fig.3 Shaking flask fermentation results of different strains

從圖3可以看出，ilvBNXV的強化表達，促進了L-纈氨酸的初步積累，雙拷貝菌株的L-纈氨酸產量可達31.2 g/L，較單拷貝菌株的產量提高了近1倍，同時其他2種支鏈氨基酸L-亮氨酸和L-異亮氨酸的積累濃度很低，因此選擇菌株A02作為可積累L-纈氨酸的基礎菌株，利用CRISPRi系統進行多個位點的干擾實驗。

2.4 aceE、gltA和kgd的弱化

因丙酮酸是L-纈氨酸合成所需的唯一前體物，因此增強丙酮酸的供應是再次提高菌株A02積累L-纈氨酸能力的關鍵。但是在微生物胞內，丙酮酸是重要的中心代謝物之一，其主要去向是經乙酰coA進入TCA循環，維持細胞正常生命活動。此外，丙酮酸是胞內代謝網絡的剛性節點，對丙酮酸相關途徑的修飾對胞內代謝有著明顯的影響，因此L-纈氨酸的積累同細胞生長之間存在著緊密聯系。為能在保證細胞正常生長的同時，將更多的丙酮酸流向L-纈氨酸合成途徑，利用本研究構建的雙質粒干擾系統對丙酮酸代謝相關靶點基因的轉錄水平進行弱化實驗。首先利用電轉化實驗將pECXK99E-dcas9質粒轉化入菌株A02，得到A03菌株，根據不同基因的啟動子區域、翻譯起始區域(DNA序列中起始密碼子ATG區域)和遠離ATG 200 bp三個區域設計弱化靶點，構建不同的pXMJ19-gRNA質粒并分別電轉入菌株A03得到不同的菌株后，進行了搖瓶實驗，發酵進行至8 h，添加0.2 mmol/L的IPTG對干擾質粒進行誘導表達，并對L-纈氨酸濃度和靶點基因的轉錄水平進行了測定，同時以帶有pECXK99E-dcas9和pXMJ19質粒的菌株A030為對照組，結果如圖4。

由圖4可知，在對aceE、gltA和kgd三個靶點基因進行不同區域干擾弱化時，3個靶點基因相對轉錄水平均出現了明顯的差異。在對3個基因的啟動子區域進行弱化時，3個基因的相對轉錄水平出現了明顯的下降，且均低于0.15；對翻譯起始區域(DNA序列中起始密碼子ATG區域)進行干擾時，3個基因的相對轉錄水平均低于0.5；而對遠離ATG區域進行干擾時，3個基因的相對轉錄水平均在0.7以上。通過測定L-纈氨酸濃度發現，基因aceE的干擾效果對促進L-纈氨酸的積累有著明顯的正向效果，在對啟動子區域進行弱化時，基因aceE的相對轉錄水平過低，細胞因TCA循環受阻出現了生長緩慢的問題，產量在30.1 g/L，而對翻譯起始區域進行干擾時，L-纈氨酸的積累濃度達34.6 g/L，較對照菌株提高了6.1 g/L，表明對丙酮酸主要代謝途徑的弱化節省的部分丙酮酸成功進入了L-纈氨酸的合成途徑。但是在對gltA和kgd進行干擾實驗時，對L-纈氨酸的積累沒有明顯的促進的作用。結果表明在L-纈氨酸生產菌株的構建中，直接決定丙酮酸去向的基因aceE是一個重要的修飾靶點，而TCA循環中的相關基因的弱化不會帶來明顯的效果。

圖4 不同干擾位點對菌株A03搖瓶發酵產L-纈氨酸的影響Fig.4 Effects of different interference sites on L-valine production

2.5 PPP途徑的弱化

除弱化丙酮酸向TCA的代謝以外，通過弱化葡萄糖向PPP途徑的代謝，也可以在一定程度上增加糖酵解途徑的碳源分配進而增加流向L-纈氨酸合成途徑的代謝流量。因胞內PPP途徑是為細胞提供還原力的主要途徑，因此在對PPP途徑進行弱化時首先要解決L-纈氨酸合成所需還原力NADPH供應的問題。在對PPP途徑進行弱化前，首先強化了可根據細胞內NADH/NADPH需要而實現兩者相互轉化的基因pntAB，并保證該基因受到較強啟動子sod的轉錄調控。在基因pntAB得到強化后，對PPP途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶(Cgl1576編碼)進行了干擾弱化，結果如圖4。對3個不同區域進行干擾時，基因Cgl1576的轉錄水平出現了明顯的差異，對啟動子區域進行干擾時，雖然靶基因的轉錄水平最低，約為正常水平的0.19，但是L-纈氨酸的產量沒有因更多碳源流入EMP途徑而提高；對翻譯起始區域(DNA序列中起始密碼子ATG附近)進行干擾是3組實驗中效果最為明顯的修飾手段，L-纈氨酸濃度可達32.3 g/L；對遠離ATG區域進行弱化時，L-纈氨酸的濃度沒有明顯提升。結果表明，對PPP途徑進行弱化來提高EMP途徑的代謝通量也可提高細胞積累L-纈氨酸的能力。

如表5所示，在對糖酵解和TCA途徑中多個基因進行修飾時，發現只有對aceE進行弱化時才會明顯促進L-纈氨酸的積累，而對基因gltA和kgd的弱化沒有表現出明顯的正向效應；對PPP途徑中Cgl1576的弱化同樣會促進L-纈氨酸的積累。因此，在L-纈氨酸生產菌株的構建中，弱化直接決定丙酮酸去向的基因和同糖酵解途徑競爭碳源的PPP途徑是有效的修飾手段。

表5 不同修飾靶點對L-纈氨酸產量的影響Table 5 Effects of different modified targets on L-valine production

2.6 aceE和Cgl1576的同時弱化

根據以上的實驗結果，發現無論是對丙酮酸相關途徑還是對PPP途徑的弱化，都起到了明顯效果。為能保證更多的碳源流向糖酵解途徑，同時糖酵解產物丙酮酸及時流向L-纈氨酸合成途徑，嘗試同時對aceE和Cgl1576的轉錄水平進行干擾弱化。對aceE的弱化方式選擇對翻譯起始區域(DNA序列中起始密碼子ATG區域)的弱化，在此基礎上對PPP途徑進行修飾時選擇了2.5小節中對基因Cgl1576的弱化方式并對得到的菌株進行了驗證，在搖瓶培養至16 h時添加作用濃度為0.2 mmol/L的誘導劑IPTG，保證弱化質粒發揮作用，32 h結束發酵并測定發酵液中的L-纈氨酸的濃度。

A0300-對照菌株; A0301-同時弱化aceE翻譯起始區域和Cgl1576啟動子區域; A0302-同時弱化aceE翻譯起始區域和Cgl1576翻譯起始區域; A0303-同時弱化aceE翻譯起始區域和Cgl1576遠離翻譯起始區域圖5 不同弱化組合方式對L-纈氨酸積累的影響Fig.5 Effects of different weakening combination on L-valine accumulation

如圖5所示，同時對EMP和PPP途徑進行修飾來積累更多的丙酮酸，進而提高細胞積累L-纈氨酸的能力取得了明顯的成果，在對aceE的翻譯起始區域(DNA序列中起始密碼子ATG區域)弱化的基礎上，對Cgl1576的啟動子區域進行干擾時，2個基因的轉錄水平受到了嚴重的弱化，維持細胞正常生長和為細胞供能的兩個代謝途徑也受到了阻礙，細胞生長緩慢，積累L-纈氨酸的能力也隨之下降；而對Cgl1576其他2個區域的弱化均有利于L-纈氨酸的積累，其中對翻譯起始區域弱化得到的菌株A0302是所有實驗組中最具潛力的菌株，可積累L-纈氨酸37.1 g/L。

3 結論

丙酮酸是L-纈氨酸生物合成所需的唯一前體物，同時是細胞內重要的剛性節點，因此在L-纈氨酸大量積累的同時，維持細胞正常生長是L-纈氨酸生產菌株構建中一直存在的瓶頸。本研究建立了應用于谷氨酸棒狀桿菌的誘導型CRISPRi技術并成功應用到L-纈氨酸生產領域，不僅保證了細胞的正常生長，而且實現了對靶點基因時空上的靈活調控。通過對TCA循環和PPP途徑中的多個基因的轉錄水平進行調控，確定了能明顯促進L-纈氨酸積累的關鍵靶點和弱化方式，關鍵靶點包括aceE編碼的丙酮酸脫氫酶亞基E1和由Cgl1576編碼的六磷酸葡萄糖脫氫酶，分別對兩個基因的翻譯起始區域(DNA序列中起始密碼子ATG區域)進行弱化是最佳的調控方式，得到菌株A03E2和A0362可分別積累L-纈氨酸34.6 g/L和32.3 g/L，較對照菌株A0300提高了6.1 g/L和3.8 g/L。為能得到更理想的代謝流分配，對aceE和Cgl1576兩個基因同時進行了弱化實驗，并對多種不同組合方式進行了驗證，最終確定同時對兩個基因的翻譯起始區域，即DNA序列中起始密碼子ATG區域，進行弱化時效果顯著，得到的菌株A0302可積累L-纈氨酸37.1 g/L，為所有實驗組中最高的產值。研究中靶點基因的修飾策略為以后L-纈氨酸生產菌株的構建提供了思路和方向。