大腸桿菌過氧化物酶EfeB在細胞氧化應激中的作用

丁亮亮，劉進生，顧鵬帥，唐蕾,2*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

為了應對氧化應激，生物體已經進化出多種保護系統，其中對于ROS的清除一般包含非酶系統和酶系統。非酶系統通常是生物體自身合成的一類具有還原性的小分子物質，如谷胱甘肽、維生素C、海藻糖以及一些酮酚類物質等[7]。酶系統一般有超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶以及葡萄糖6-磷酸脫氫酶等[8-10]，其中過氧化物酶屬于氧化還原酶，廣泛存在于各種生命體中，大多數是血紅素過氧化物酶，并可以利用H2O2催化其他化合物，在生物合成、降解及防御等方面發揮重要作用[11]。過氧化物酶EfeB，最初被作為大腸桿菌“雙精氨酸”易位系統的底物進行了研究，是第一個公認的細菌染料脫色過氧化物酶[12]。后續研究表明,EfeB是以血紅素為輔基的過氧化物酶，而且具有特異性的鐵轉運功能[13]。目前對于染料脫色過氧化物酶的研究主要集中在提高酶活力及降解底物方面[14-16]，大腸桿菌中關于EfeB在氧化應激條件下對胞內生理狀況的調控機制尚不清楚。

本文以E.coliBL21(DE3)為出發菌株，通過efeB的敲除及過量表達，分別探究了在不同條件下efeB對菌體生長、丙二醛濃度、ROS合成以及抗氧化途徑關鍵酶基因表達水平的影響，為尋找調控胞內氧化應激的策略提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

實驗所用菌株和質粒見表1；本研究中所用引物由天霖生物科技(無錫)有限公司合成，引物詳細信息見表2。

表1 本研究中使用的菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 主要試劑與儀器

限制性內切酶EcoR I、XhoI和T4 DNA連接酶、質粒提取、純化試劑盒，TaKaRa公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit、ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司；活性氧測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素(kanamycin，Kan)、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)和氯霉素(chloramphenicol，Chl)，生工生物工程(上海)有限公司。

核酸電泳儀、凝膠成像系統， Bio-Rad 公司；可見光分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；Enspire 多標記檢測系統(酶標儀)，珀金埃爾默有限公司；激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡公司；流式細胞儀，美國BD公司；實時熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司。

1.1.3 培養基及培養條件

LB 培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，固體LB培養基再加入2%的瓊脂。抗性培養基添加的Amp、Kan和Chl終質量濃度分別為100、50、25 mg/L，IPTG終濃度0.2 mmol/L。

搖瓶發酵條件：250 mL搖瓶裝液量50 mL，37 ℃、200 r/min搖床培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒構建

以E.coliBL21(DE3)的基因組為模板，設計引物UefeBF/UefeBR通過PCR擴增得到efeB目的片段(1272 bp)。純化后的片段與載體pET28a經過EcoR I和XhoI酶切后，通過T4 DNA連接酶進行連接，并將連接產物轉化到E.coliJM109感受態中，在Kan抗性平板上篩選陽性轉化子，進行雙酶切驗證和基因測序(天霖生物科技(無錫)有限公司)，將序列正確的質粒定名為pEE。

1.2.2 大腸桿菌efeB的敲除

以E.coliBL21(DE3)的基因組為模板，設計目的基因efeB上下游各500 bp的同源序列的引物。分別用引物對UefeBF/UefeBR和DefeBF/DefeBR擴增出efeB上游的同源序列基因UefeB和下游的同源序列基因DefeB，并以pKD4質粒為模板設計引物kanF和kanR，擴增含有Kan抗性片段及其兩端FRT基因kan。將經過EcoR I和XhoI酶切后的線性質粒pET22b與以上擴增出的3個基因片段利用ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit試劑盒進行連接，并將連接產物轉化入感受態E.coliJM109中，在Kan和Amp雙抗平板上篩選陽性轉化子，進行驗證，最終得到質粒pEUKD。

進一步以質粒pEUKD為模板，利用引物KefeBF/KefeBR進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL)：模板1 μL，Primerstar Max DNA polymerase 25 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；X℃ 15 s；72 ℃Ys；30個循環；72 ℃ 10 min (其中退火溫度X根據不同基因片段的引物Tm值進行設置，延伸時間Y則根據片段長度按照每分鐘擴增1 000個堿基的速度進行分配設置)。最終得到兩端帶有500 bpefeB基因上下游同源序列，中間為含FRT位點的Kan抗性基因的DNA打靶片段,用于敲除efeB基因。

大腸桿菌efeB的敲除具體過程為：將2502 bp左右的線性打靶片段電轉入感受態E.coliBL21(DE3)/pKD46后，并迅速加入1 mL LB液體培養基，在37 ℃、200 r/min條件下振蕩復蘇12 h進行同源重組，之后均勻涂布在含有Kan抗性的固體LB平板上，篩選陽性重組菌。挑取陽性單菌落，以E.coliBL21(DE3)為對照，利用引物對JefeBF/ JefeBR進行菌落PCR擴增，驗證條帶大小正確后，再導入pCP20質粒，30 ℃振蕩培養4 h后，涂布至Amp抗性平板上，于30 ℃過夜培養。以E.coliBL21(DE3)為對照，利用引物JefeBF/JefeBR進行菌落PCR擴增，驗證條帶大小和測序驗證正確后，再通過42 ℃培養，消除胞內質粒，得到沒有任何抗性的EcoΔefeB[19]。

1.2.3 培養方法

將各菌株于LB 液體培養基中在37 ℃,200 r/min條件下活化12 h后，按體積分數1%接種量轉移至50 mL LB液體培養基中培養并加入相應的抗生素，需要添加誘導劑的菌株，在培養2 h后，加入終濃度0.2 mmol/L的IPTG進行誘導培養。

1.2.4 重組蛋白表達及SDS-PAGE檢測

參照CHEN等[17]實驗方法檢測重組菌株蛋白表達情況。

1.2.5 外源添加H2O2濃度的確定

將E.ColiBL21(DE3)于LB液體培養基中37 ℃下過夜培養后，按體積分數1%接種量接種至50 mL LB液體培養基中，培養至OD600為0.3，然后在搖瓶中添加不同終濃度的H2O2：1、2、4、8和16 μmol/L。沒有H2O2處理的為對照組，在樣品培養2、4、6、8、10和12 h后，測量并記錄OD600[20]。

1.2.6efeB基因敲除及過表達對大腸桿菌生長的影響

測定方法同1.2.5。

1.2.7 細胞膜脂質過氧化水平的測定

參考曾昕[21]的方法。利用脂質過氧化產物丙二醛(malondialdehyde, MDA)與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)的顯色反應來測定。在對數期收集細胞，并與TBA以1∶1的體積比混合，置于沸水浴中12 min后迅速轉入冰水浴中冷卻。在室溫條件下，經12 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液至96孔酶標板中，通過酶標儀分別測定其在450、532和600 nm波長處的吸光值。并通過公式(1)計算MDA的含量(nmol/g蛋白)。

(1)

1.2.8 胞內活性氧檢測

采用化學熒光法[22]。在菌體生長至對數生長期時，取200 μL菌液置于1.5 mL離心管中，加入800 μL 磷酸鹽緩沖液進行稀釋懸浮后，再加入濃度為10 mmol/L的2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-dichlorofluorescent yellow diacetate, DCFH-DA)1 μL，充分混勻后置于37 ℃，200 r/min搖床中，反應1 h。12 000 r/min離心5 min棄上清液，收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌2次后棄上清液，再加入200 μL的磷酸鹽緩沖液重懸菌體并制片，在激光共聚焦顯微鏡下進行胞內ROS定性檢測。其中，顯微鏡檢測條件為：激發波長502 nm，發射波長530 nm。之后采用同樣方法染色，取1 mL重懸菌液，利用流式細胞儀進行胞內ROS定量檢測。

1.2.9 基因轉錄水平檢測

efeB過表達菌株于37 ℃,200 r/min過夜培養后，以體積分數1%的接種量轉接至新鮮LB培養基中，培養2 h后加入IPTG誘導劑，并誘導到對數生長期。在4 ℃，12 000 r/min離心5 min后收集菌體，并用50 mg/mL的溶菌酶在37 ℃下破壁10 min。按照試劑盒說明書進行總RNA提取，提取的RNA濃度及純度使用核酸定量儀測定，之后將 RNA 直接反轉錄成cDNA用于熒光定量實驗。以上述cDNA為模板進行熒光定量PCR，熒光定量PCR引物見表3，選擇編碼 3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因gapA作為內參基因，采用SYBR?Green I嵌合熒光法，反應體系參照試劑盒說明書。

表3 本研究所用熒光定量 PCR 引物Table 3 Primers for fluorescent quantitative PCR used in this study

2 結果與分析

2.1 EcoΔefeB和Eco/pEE菌株的構建

以質粒pEUKD為模板，利用引物對KefeBF/KefeBR擴增得到長度為2 502 bp的打靶片段(圖1-a)。將打靶片段電轉進E.coliBL21(DE3)/pKD46 后，利用引物JefeBF/JefeBR進行菌落 PCR鑒定，同源重組成功后理論上可獲得2 613 bp片段，而E.coliBL21(DE3)則為2 383 bp片段，結果表明挑取的菌落均可擴增出2 613 bp片段(圖1-b)，同源重組成功。轉入pCP20質粒后，利用引物對JefeBF/JefeBR進行菌落pCR鑒定，efeB敲除成功的菌落理論上PCR結果為1 159 bp (保留一個FRT位點)，而E.coliBL21(DE3) PCR結果為2 383 bp，結果表明挑取的菌落均可擴增出1 159 bp片段(圖1-c)，對驗證正確的敲除菌測序，結果正確，表明efeB被成功敲除，并將敲除菌命名為EcoΔefeB。

a-打靶片段的PCR擴增:1～5-打靶片段；b-打靶片段導入后的菌落PCR驗證:M-Marker；1～4-打靶片段重組成功的菌株,5-E. coli BL21(DE3)對照；c-Kan抗性基因消除后的PCR擴增:M-Marker,1～4：efeB敲除菌株，5-E. coli BL21(DE3)對照；d-pEE質粒的雙酶切:M-Marker,2～3-pEE圖1 efeB基因敲除與重組質粒pEE的電泳驗證Fig.1 Electrophoretic verification of efeB gene knockout and recombinant plasmid pEE

通過EcoRI和XhoI雙酶切鑒定pEE質粒，efeB長度為1 272 bp，pET28a 質粒雙酶切后為5 335 bp，雙酶切條帶大小與理論一致(圖1-d)，對構建的質粒測序，結果正確，將pEE轉化入E.coliBL21(DE3)中，得到菌株Eco/pEE。

2.2 重組蛋白表達及SDS-PAGE檢測

為了檢測過表達菌株EfeB誘導后是否表達，對Eco/pEE菌株誘導后進行SDS-PAGE檢測，EfeB蛋白分子量約為46 kDa，其蛋白表達檢測結果如圖2所示，過表達菌株在添加IPTG誘導后與對照菌株相比，檢測到重組蛋白，目的條帶的大小與電泳圖中的位置吻合，因此EfeB蛋白表達量增加，重組菌株Eco/pEE可以用于后續實驗。

M-Marker；1-E.coli BL21；2-Eco/pEE(-IPTG)； 3-Eco/pEE (+0.2 mmol/L IPTG)圖2 重組蛋白的檢測Fig.2 Detection of recombinant protein

2.3 H2O2濃度對大腸桿菌生長的影響

H2O2對大腸桿菌生長的影響如圖3所示。在對照組中，細菌數量在前6 h內迅速增加，然后生長趨于穩定。與對照組相比，用濃度為1、2和4 mmol/L的H2O2處理大腸桿菌在培養期間顯示出細胞數量的有所下降。這表明H2O2的濃度在低于最低抑菌濃度下，不能完全抑制大腸桿菌的生長，當H2O2濃度為16 mmol/L時，細菌數量明顯減少且不再增加，表明劑量為16 mmol/L的H2O2能夠完全抑制大腸桿菌的生長。實驗表明,外源添加濃度為4 mmol/L的 H2O2產生的氧化應激效應會使大腸桿菌產生顯著的生長抑制，但是不會引起細胞的死亡，因此采用4 mmol/L的H2O2作為氧化應激條件。

圖3 用H2O2處理大腸桿菌BL21(DE3)的生長曲線Fig.3 Treatment of growth curve of E.coli BL21(DE3) with H2O2

2.4 efeB基因敲除及過表達對大腸桿菌生長的影響

為了分析efeB的缺失及過表達是否能夠影響菌株的生長，測定了出發菌株與EcoΔefeB及過表達菌株Eco/pEE在正常培養及外源添加4 mmol/L H2O2刺激下的生長曲線，結果如圖4所示。

圖4 不同菌株的生長曲線Fig.4 Growth curves of different strains

由圖4可知，相比于出發菌株，在正常狀態及H2O2刺激培養條件下,過表達efeB均促進了菌株的生長；在正常狀態下,efeB的缺失未對菌體生長產生顯著影響，但在H2O2刺激下，敲除菌株的生長在2～8 h明顯受到抑制。以上結果表明在氧化應激狀態下，EfeB蛋白在維持胞內氧化還原平衡，促進菌體生長方面發揮重要作用。

2.5 細胞膜脂質過氧化水平的測定

MDA是細胞膜受到胞內ROS攻擊后的主要產物，MDA含量的變化可以反映出大腸桿菌胞內的受損程度[23]。由圖5可以看出，在正常條件下，EcoΔefeB菌株與出發菌株相比，胞內MDA含量有所升高，這說明efeB的缺失加劇了胞內氧化損傷，而Eco/pEE菌株與出發菌株相比，胞內MDA含量大幅度下降，說明Eco/pEE菌株有著更強抗氧化能力，即efeB基因的表達有利于減輕胞內因氧化應激帶來的損傷。另外通過外源添加H2O2發現所有菌株胞內MDA含量均有所升高，即加劇了胞內的氧化損傷水平，整體含量變化趨勢與文獻報道一致[24]，該結果表明了efeB基因在減少胞內因ROS引起的氧化損傷方面具有重要作用。

圖5 不同菌株胞內脂質過氧化水平測定Fig.5 Determination of intracellular lipid peroxidation levels in different strains

2.6 胞內活性氧檢測

DCFH-DA沒有熒光，進入細胞后被酯酶水解為DCFH。在ROS存在時DCFH被氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質DCF，其熒光在激發波長502 nm，發射波長530 nm附近有最大波峰，強度與細胞內ROS水平成正比。用激光共聚焦顯微鏡定性檢測胞內ROS，如圖6-b所示，菌體呈現綠色熒光，表明染色成功，在此基礎上用流式細胞儀進行胞內ROS定量檢測，最終以熒光值來比較不同菌體之間的胞內ROS含量，結果如圖7所示。

a-激光共聚焦顯微鏡透射光通道成像;b-激光共聚焦顯微鏡透射光與熒光重疊成像圖6 大腸桿菌激光共聚焦顯微鏡染色成像Fig.6 Staining image of E.coli under laser confocal microscopy

圖7 不同菌株胞內ROS測定Fig.7 Determination of intracellular ROS in different strains

由圖7可知，在LB培養條件下，EcoΔefeB菌株的胞內ROS含量降低，但該菌的MDA含量卻是最高(圖5)，同時Eco/pEE菌株的胞內ROS含量升高，但對應的MDA含量卻是最低(圖5)，結合3株菌在不同培養條件下的生長狀況分析(圖4)，導致EcoΔefeB菌株胞內ROS含量低于出發菌株的原因可能是EcoΔefeB菌株生長緩慢，菌體呼吸活力低，呼吸鏈傳遞速率慢，同時也減少了電子泄露的可能性，從而導致EcoΔefeB菌株ROS低于出發菌株，而Eco/pEE菌體由于活力強于出發菌株，以至于Eco/pEE菌株呼吸活力高，呼吸鏈的電子傳遞速率快，但同時增加了電子泄露的可能性，導致ROS高于出發菌株[25]，但由于EfeB的抗氧化應激作用，細胞膜的氧化損傷卻明顯低于出發菌株，表現在MDA的水平僅為出發菌株的15%(圖5)。在外源添加H2O2條件下，3株菌的ROS含量進一步提升，各菌株胞內ROS含量趨勢與LB正常培養條件下基本一致。

2.7 基因轉錄水平檢測

為了探究efeB過表達對于efeB相關基因及抗氧化體系中關鍵基因的調控影響，對關鍵酶基因efeU、efeO、sodA、katE、oxyR、recA的轉錄水平進行了實時熒光定量 PCR分析，其基因轉錄水平的變化結果如圖8所示。

圖8 Eco/pEE菌株抗氧化途徑中各基因的相對轉錄水平Fig.8 Relative transcript levels of each gene in the antioxidative pathway of Eco/pEE strain

在大腸桿菌中，EfeUOB系統是三聯鐵轉運蛋白，在革蘭氏陰性細菌中低pH條件下發揮鐵轉入及改變鐵離子價態的功能[13]。從圖8可以看出，efeB過表達菌株在LB 培養條件下，efeU和efeO發生了不同程度的上調，這2個基因涉及鐵離子的轉運，因此efeB的過表達促進了鐵的轉運。3個氧化應激相關基因sodA、katE和oxyR的轉錄水平也發生了不同程度的變化,sodA是大腸桿菌中表達超氧化物歧化酶的關鍵結構基因，其可以在超氧化物脅迫下保護細胞[26]。oxyR在大腸桿菌中受H2O2脅迫誘導，從而增強抗氧化防御，涉及過氧化氫酶和過氧化物酶的調控表達[27]。sodA和oxyR分別上調了2.48倍和1.95倍，這表明efeB過表達菌株為了降低ROS水平啟動了其他抗氧化系統。負責過氧化氫酶的基因katE的轉錄水平下調了87.62%，在添加H2O2刺激后更是下調了94.81%，表明efeB基因的過表達，在維持胞內ROS的氧化還原平衡方面，尤其是H2O2的消除方面發揮了重要作用，相關機制有待進一步研究。除此之外，DNA損傷反應調節基因recA也受到了影響，recA的表達有所上調，細菌重組酶recA在DNA損傷反應中對調節DNA修復至關重要[28]。通過外源添加H2O2進一步驗證，與對照組基因轉錄水平趨勢一致。

3 結論

本研究旨在探究大腸桿菌EfeB在細胞氧化應激下的作用機制，通過測定不同菌株在正常狀態及H2O2刺激條件下胞內ROS、MDA含量以及相關基因的轉錄情況來評估細胞內氧化應激狀態的變化。結果表明大腸桿菌EfeB蛋白在消除胞內ROS及減少氧化損傷方面發揮重要作用，其中過表達efeB能夠有效地調節細胞在氧化脅迫下胞內氧化還原的平衡，促進細胞生長。因此，它可能是一種安全的抗氧化劑的潛在候選者，本研究結果對其抗氧化功能的開發和利用提供了一定的理論依據。