茶多酚對面團中面筋蛋白結構的影響

皮俊翔,張根義

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

多酚類物質在自然界中有著廣泛的分布,因為其含有苯酚結構而具有良好的抗氧化性能,在食品體系中添加多酚類物質不僅可以改善食品本身品質,而且還可以提高食品的功能性質[1]。茶葉在中國有著5000多年的歷史,分布廣泛且資源豐富,茶多酚作為茶葉內存在的多酚類物質經研究被證明具有一系列有益的生理活性功能,因而被廣泛的應用于食品的各個領域,包括水產品的防腐、功能性食品的添加、護色等[2-6]。Fan等[7]的研究了添加不同濃度茶多酚對魚肉的保鮮作用,發現茶多酚可以有效的降低魚肉內各種酶的活性及有害細菌的增長繁殖。Jen等[8]研究表明了茶多酚可以通過下調細胞核中的脂肪酸合酶基因表達并刺激線粒體增加細胞能量消耗實現其降血脂和抗肥胖的作用。Qian等[9]通過配比茶黃素與脂溶性茶多酚的最佳組合,維持了牛肉條的良好色澤延長了其保質期。

隨著人們對健康食品需求的增加,近些年來不斷有人研究多酚類物質作為添加劑在面制品中對其加工性能及功能品質的影響。Alina等[10]在面包中添加脫咖啡因紅茶粉的提取物增強了面包的抑菌性能并有效的延長了其貨架期。胡建輝等[11]、潘俊嫻等[12]、李華等[13]、張海華等[14]分別研究了茶制品、茶多酚EGCG、茶多酚對面團流變性能的影響。目前對面團中添加茶多酚的研究多集中于其加工特性,而較少涉及面團中面筋蛋白其微觀結構的具體變化,對茶多酚具體作用于面團的機理研究不夠充分。

面筋蛋白是影響面團加工性質的主要因素[15]。因此,為了進一步了解茶多酚的加入對面團作用的機理,需要具體研究茶多酚對面團中面筋蛋白結構變化的影響。目前蛋白質二級結構的測定技術除了拉曼光譜外,還包括傅立葉紅外光譜技術、圓二色譜技術、熒光光譜技術等,其中拉曼光譜檢測技術方便快捷,受水相干擾小,可以實現對固相和液相的無損檢測,因而被廣泛的應用于各個領域[16]。本實驗旨在通過對面團中濕面筋、游離氨基、自由巰基含量的測定及利用拉曼光譜檢測和顯微電鏡觀察技術研究面筋蛋白微觀結構的變化,進一步了解茶多酚如何在微觀層面上作用于面筋蛋白從而影響面團的加工性質,為擴大茶多酚在面制品中的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶多酚 純度97.46%,杭州禾田生物技術有限公司;高筋小麥粉 水分含量(12.4 g/100 g),粗蛋白含量(15.28 g/100 g),灰分含量(0.74 g/100 g),濕面筋含量(44.14 g/100 g),濱州中裕食品有限公司;鄰苯二甲醛(OPA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、羅丹明B(分析純)、Tris-HCl緩沖液(生物純) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二硫蘇糖醇(DTT)、5,5-二硫代2-硝基苯甲酸(DTNB) 分析純,百靈威科技有限公司;異硫氰酸熒光素 純度90%,上海麥克林生化科技有限公司;十水四硼酸鈉、異丙醇、冰醋酸、甲醛、丙酮、濃硫酸等其它試劑 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

AR2130電子精密天平 奧豪斯國際貿易(上海)有限公司;K9481凱氏定氮儀 濟南海能儀器有限公司;SX-2-2.5-20馬弗爐 上海電機集團公司;ZNCL-GS磁力攪拌水浴鍋 上海科升儀器有限公司;H01-1A恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;Farinograph-E型粉質儀 德國Brabender公司;SCIENTZ-10ND冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;UV-1800紫外可見風光光度計 島津(上海)實驗器材有限公司;LabRam-HR800顯微共聚焦拉曼光譜儀(8 mW,He-Ne激光器) 法國HORIBA Jobin Yvon S.A.S.公司;su1510掃描電子顯微鏡 日本日立株式會社;LSM 710激光共聚焦顯微鏡 德國Lavision Biotec公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 面團粉制備 制備四份分別含有0、0.5%、1.0%、2.0%的茶多酚混合粉294.5 g(面粉含水率12.4%),加等量水后于粉質儀中一定時間攪拌后取出置于保鮮膜內,室溫下松弛20 min后于-68 ℃冰箱中速凍,真空冷凍干燥磨粉(60目)后用于后續實驗檢測。

1.2.2 面筋含量及其吸水率的測定 濕面筋制配方法參照國標GB/T 5506.1-2008,稱取10 g混合粉于小搪瓷碗中,不斷滴加氯化鈉溶液并揉捏以洗去面團中的淀粉顆粒,直至洗滌液中無淀粉檢出。排水后稱重,濕面筋質量記為m1。隨后將所得濕面筋冷凍后置于凍干機中凍干,凍干后質量記為m2,計算面筋吸水率。

濕面筋含量(%)=m1/10×100

干面筋含量(%)=m2/10×100

面筋吸水率(%)=(m1-m2)/m2×100

1.2.3 游離氨基含量的測定 面團中游離氨基的檢測參照Nielsen等[17]的研究方法。取20 mg凍干面團粉于4 mL OPA試劑中,混合反應后離心去除沉淀測定溶液在340 nm處測定樣品吸光度值,樣品中游離氨基的濃度同吸光度成正比。

1.2.4 自由巰基含量的測定 面團中自由巰基(-SH)的含量測定參考Wang等[18]的方法。先稱取50 mg凍干面團粉于7 mL離心管,隨后加入4 mL Ellman’s溶液,10 min搖勻后離心(8000 r/min),取上清液于波長412 nm處測定吸光值可得SH自由吸光度。依次測定0、0.5%、1.0%、2.0%茶多酚添加后面團的吸光值,樣品中自由巰基的含量同吸光度成正比。

1.2.5 拉曼光譜掃描測定 拉曼測定的方法參考Zhou等[19],將不同茶多酚添加量的凍干后獲得的面團粉放置在包裹一層錫箔紙上的玻璃片上,隨后用激光光源進行激光聚焦。測定條件如下:測試波長632.8 nm,波長掃描范圍為200～3500 cm-1,激光能量10 mW,分辨率2 cm-1,數據采集時間30 s,掃描次數為10次,數據獲取時間為120 cm-1/min。

1.2.6 面團顯微結構觀察 將所得樣品取截面進行噴金處理后置于掃描電子顯微鏡下觀察其微觀結構變化。

激光共聚焦顯微測定參考Silva等[20]的方法。先用去離子水作為溶劑,配制濃度為0.25%(w/w)的異硫氰酸熒光素(FITC)和0.025%的羅丹明B熒光染液。取適量濕面團于載玻片,隨后滴入異硫氰酸熒光素和羅丹明B熒光染液分別對淀粉和面筋蛋白進行染色,靜置2 min后蓋上蓋玻片用于顯微鏡觀察。測試條件如下:物鏡放大倍數20×,目鏡放大倍數10×,異硫氰酸熒光素和羅丹明B 的激發波長分別為488和568 nm,二者發射波長則為518和625 nm。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同添加量的茶多酚對高筋小麥粉面筋含量及吸水率的影響

面團面筋蛋白網絡結構的形成有利于包裹淀粉顆粒,賦予面團良好的粘彈性。表1中顯示了高筋小麥粉面筋蛋白含量及吸水率隨著不同含量茶多酚添加后的變化情況。表1可以看出,隨著茶多酚的添加,濕面筋的含量顯著(P<0.05)下降,在茶多酚含量添加為2.0%時,濕面筋和干面筋含量分別降低了93.32%和92.44%,說明茶多酚的添加破壞了面筋網絡結構的形成。此外,面筋的吸水率也呈現出隨著茶多酚的添加而顯著降低的趨勢。這可能是由于茶多酚具有抗氧化性,能夠還原面筋蛋白中的二硫鍵形成自由巰基,從而抑制了麥谷蛋白分子間的聚合,破壞了面筋蛋白網絡的形成[21]。Han等[22]的研究也表明,隨著面團體系中抗氧化劑添加,其內可溶性高分子量亞基的含量顯著增加,這也表明了面筋蛋白網絡的聚集受到了抑制。此外,茶多酚由于其多羥基結構且優先于水分羥基形成氫鍵,故可能在混合粉中加入水分后會先同面筋蛋白結合,降低面筋蛋白的吸水率,改變蛋白質二級結構,使其變得無序[23]。二者協同作用,最終使得麥谷蛋白、麥醇溶蛋白在混合體系中處于隔離狀態,從而不能形成面筋網絡,導致濕面筋含量的顯著降低。張海華等[14]實驗結果也表明茶多酚含量添加在2%時,面筋蛋白網絡幾乎完全被破壞,面團不能進行正常拉伸實驗。

表1 茶多酚對高筋小麥粉面筋含量及其吸水率的影響Table 1 Effects of different addition of tea polyphenol(TP)on the gluten content and the water absorption

2.2 不同添加量的茶多酚對面團中游離氨基含量的影響

面筋蛋白的側鏈含有大量的氨基、羥基和羧基,Brudzynski等[24]和Lee等[25]提出這些基團可以同多酚類物質結合形成氫鍵等非共價作用力。段云龍[26]的研究表明隨著茶葉添加物中酚類物質同蛋白質側鏈上自由氨基的非共價鍵作用,面團中的自由氨基量呈現顯著下降的趨勢,但是在本實驗結果中所測得的自由氨基的含量則隨著茶多酚的增加而呈現顯著增加的趨勢。如圖1所示,隨著茶多酚含量的逐漸增加,面團粉中自由氨基的含量分別為對照組的1.57、2.51和4.13倍。

圖1 不同添加量的茶多酚對面團中游離氨基的影響Fig.1 Effects of the different addition of tea polyphenol(TP)on the contents of free amino in the dough注:不同小寫字母表示數據差異顯著,P<0.05;圖2同。

結合2.1結果表明這可能是因為茶多酚的添加破壞了面筋蛋白網絡的形成,其內蛋白分子相互處于“孤立”狀態,從而使得面團體系內自由氨基含量上升[27]。這也表明了面團體系內自由氨基的含量變化是一個動態的過程,即茶多酚內的羥基可以同自由氨基結合降低其含量,但又因為其抑制了面筋蛋白網絡結構的形成而增加了其內的自由氨基含量,本實驗結果表明后者起主導地位。

2.3 不同添加量的茶多酚對面團中自由巰基含量的影響

二硫鍵的存在有利于面筋蛋白網絡結構的形成,其在面團中的含量降低會影響面筋蛋白網絡結構的形成并最終弱化面制品的品質,在面團中添加多酚類物質會還原面筋蛋白中的二硫鍵,導致體系內自由巰基含量的升高[26]。添加不同含量茶多酚后面團中存在的自由巰基含量的變化如圖2所示。從圖2中可以得出自由巰基的含量隨著茶多酚的添加而顯著(P<0.05)上升,自由巰基含量較對照組分別增加了48%、69%、111%。這是因為茶多酚因其多羥基結構而具有還原性質,在面團中添加時會還原S-S鍵,從而使得體系中自由巰基的含量上升,這一特性會影響高筋小麥面團中面筋蛋白結構網絡的形成。Zhang等[21]在面團中添加單寧也得出了類似的結論,自由巰基的含量隨著單寧添加量的增加而增加。

圖2 不同添加量的茶多酚對面團中自由巰基的影響Fig.2 Effects of the different addition of tea polyphenol(TP)on the contents of sulfhydryl in the dough

2.4 不同添加量的茶多酚對面團拉曼光譜圖的影響

不同添加量的茶多酚面團粉拉曼吸收光譜圖見圖3。已知,1800～500 cm-1是拉曼的指紋圖譜區,在添加了不同量的茶多酚后面團在該區域內的變化顯著,表明了茶多酚的添加對蛋白質的空間結構和氨基酸殘基的環境有顯著的影響;此外,在C-H振動區和羥基振動區(3400～2800 cm-1)也出現了出峰位置的變化[28]。通過對以上區域進行具體分析有助于解釋面團在加入茶多酚后其蛋白質的變化,具體出峰位置及其振動來源[28-30]如表2所示。

表2 面團拉曼光譜中譜帶的歸屬Table 2 Tentative assignment of selected bands in the Raman spectra of dough

2.4.1 不同添加量的茶多酚對C-H及羥基伸縮振動的影響 研究表明蛋白質、多肽及芳香族氨基酸中C-H的伸縮振動會在2900 cm-1附近位置處出峰,見圖4[28]。從圖4中可以看出隨著茶多酚的添加吸收峰的位置逐漸由2922.76 cm-1偏移至2943.64 cm-1,推測可能是由于混合粉中添加的親水性茶多酚同水分子羥基競爭氫鍵結合位點,從而影響了面筋蛋白主鏈構象的變化,導致了吸收峰位置的偏移。圖5中羥基振動的出峰位置隨著茶多酚的添加由對照組中的3257.33 cm-1升至3301.13 cm-1,表明了茶多酚的添加增強了混合體系中的氫鍵作用[31]。這可能是由于茶多酚的多羥基結構所導致,Sivam等[23]研究也表明多酚類物質的添加可以增強面團體系內的氫鍵作用。

圖4 面團的C-H基團伸縮振動拉曼圖譜Fig.4 Raman spectra of C-H stretching vibrations of dough

圖5 面團的-OH基團伸縮振動拉曼圖譜Fig.5 Raman spectra of -OH stretching vibrations of dough

2.4.2 不同添加量的茶多酚對面團中蛋白質二級構象的影響 拉曼指紋圖譜中的1220～1275和1600～1700 cm-1分別表示酰胺Ⅲ帶和酰胺Ⅰ帶,其振動信息源自多肽鏈的主鏈結構[30]。在酰胺Ⅲ帶中,1230～1245 cm-1區域表現的是蛋白質二級結構中β-折疊譜帶,而1240～1255 cm-1則表示的是無規則卷曲譜帶,從圖6中可以看出對照組中1274.98和1264.14 cm-1處的峰強在添加茶多酚后減弱了,這意味在茶多酚添加蛋白質β-折疊和無規則卷曲結構所占蛋白質二級結構比例會上升,即蛋白質結構會變得無序化,又因為β-折疊和無規則卷曲的譜帶存在重合現象,所以用酰胺Ⅰ帶(1600～1670 cm-1)對蛋白質結構進行定量分析。酰胺Ⅰ帶1645～1660、1660～1670、1670～1680、1680～1690 cm-1處分別表示蛋白質的α-螺旋、無規則卷曲、β-折疊、β-轉角二級結構[32]。從圖7中也可以得出蛋白質β-折疊處(1666.38 cm-1)吸收峰增強了,同酰胺Ⅲ帶中結論一致。圖8、圖9表示了面團中酰胺I帶的peakfit擬合圖及不同蛋白質二級結構比例圖。從圖9中可以得知2.0%的茶多酚加入使得α-螺旋結構的含量降低了21.91%,相對應的無規則卷曲結構和β-折疊結構則分別增加了17.20%和5.07%。β-轉角變化并無明顯規律,但可以得知是茶多酚的加入降低了α-螺旋的結構,使蛋白質二級結構變得無序。這可能是由于茶多酚中酚羥基優先結合面筋蛋白側鏈基團,從而影響了蛋白質的二級結構[23]。

圖6 面團酰胺Ⅲ帶拉曼光譜圖Fig.6 Raman spectra in amide Ⅲ region of dough

圖7 面團酰胺I帶拉曼光譜圖Fig.7 Raman spectra in amide I region of dough

圖8 不同茶多酚量添加的面團酰胺Ⅰ帶拉曼去卷積和曲線擬合圖Fig.8 Deconvolved and curve-fitted Raman bands of amide Ⅰ of dough at the different addition of tea polyphenols(TP)

圖9 面團蛋白質二級結構相對含量Fig.9 Secondary structure contents of dough

2.4.3 不同添加量的茶多酚對面團氨基酸殘基微環境的影響 蛋白質三級結構變化趨勢可通過分析其中的氨基酸殘基在其對應波數范圍附近吸收強度變化而得知。其中,苯丙氨酸因其吸收穩定性而常用作歸一化因子[30]。從圖10中可以得出酪氨酸殘基中對位取代苯環振動形成的費米共振雙峰I850/I830值遠大于普通面團中的正常值(0～1.45),其原因可能是被880 cm-1處的強吸收峰掩蓋而導致[33]。757 cm-1附近則為色氨酸殘基吸收峰,通過對高斯去卷積前面團拉曼光譜圖的分析,該波數附近出峰位置相對強度I757從對照組開始逐漸降低,分別為0.486、0.412、0.148、0.137,其值逐漸降低表明色氨酸殘基逐漸暴露,這可能也是茶多酚的多羥基結構優先于水分羥基同蛋白質側鏈以氫鍵作用相結合,從而導致了蛋白質的三級結構的變化[30]。

圖10 面團中蛋白質氨基酸殘基微環境拉曼光譜圖Fig.10 Raman spectra of amino residue microenvironments of dough

2.4.4 不同添加量的茶多酚對面團二硫鍵變化的影響 圖中波數為500～550 cm-1處屬于S-S鍵的拉曼光譜區,在該特征頻率間S-S主要存在三種結構形式包括扭-扭-扭、扭-扭-反、反-扭-反,特征頻率分別出現在510、525、535 cm-1附近,且隨著吸收頻率增加,S-S鍵結構逐漸變得不穩定,即反-扭-反是最不穩定的結構[34]。S-S結構同蛋白質的功能關系密切,對在面團中形成穩定的蛋白結構起著重要的作用。從圖11中可以看出隨著茶多酚的添加吸收峰偏向高波數方向移動,這說明S-S結構逐漸變得不穩定。曲線擬合后S-S結構定量分析見表3,隨著茶多酚的添加,面團中S-S鍵中扭-扭-扭結構相對含量在對照組中較2.0%茶多酚添加劑量組顯著降低(4.97%);添加不同量的茶多酚后相比于對照組中,S-S鍵的扭-扭-反結構相對含量均有顯著增加,分別為2.99%、5.98%、13.42%;而對反-扭-反結構則無顯著性影響。綜上所述,茶多酚的添加使得S-S中的扭-扭-扭結構向扭-扭-反結構轉變,降低了S-S鍵的穩定性,不利于形成穩定的面筋網絡狀結構,同2.3中得出結論一致。劉滔[27]的研究也表明了在面團中添加柿單寧會弱化二硫鍵的穩定性,這可能是由于多酚類物質本身所具有的抗氧化性質所導致。

表3 不同添加量的茶多酚面團二硫鍵(505～545 cm-1)的伸縮振動Table 3 Raman S-S stretching vibrations in the 505～545 cm-1 region of dough enriched with different levels of tea polyphenols powder

圖11 面團二硫鍵伸縮振動拉曼光譜圖Fig.11 Raman spectra of the stretching vibrations of disulfide bonds of dough

2.5 不同添加量的茶多酚對面團微觀結構的影響

添加不同含量茶多酚后的面團與面筋蛋白的掃描電鏡圖(1000倍)和激光共聚焦顯微鏡圖(200倍)如圖12所示。從圖12S-0到S-2.0和圖12C-0到C-2.0中可得出,隨著茶多酚含量在面團中的增加,淀粉顆粒表面所覆蓋的面筋網絡開始斷裂(圖12S-0中網狀部分)且含量逐漸減少(圖12C-0中黃色部分)。未添加茶多酚時(圖12S-0、C-0),可以看出面筋蛋白的網絡狀形態保持良好,均勻的覆蓋在大小淀粉顆粒的表面。當開始添加0.5%含量的茶多酚時(圖12S-0.5),雖然可以看出其仍然呈連續膜狀,但是其面筋蛋白的表面均勻度與光滑度都較對照組更差,且面筋蛋白部分開始斷裂呈現出松散的狀態(圖中紅色箭頭標記處);繼續添加茶多酚使其在混合粉中含量達1.0%時(圖12S-1.0)面筋蛋白網絡進一步被破壞,其網絡狀結構開始變得不連續,對照組中被面筋蛋白覆蓋住的淀粉顆粒也進一步顯露出來;最后,當茶多酚的含量添加到2.0%時,可見大量的淀粉顆粒裸露在外(圖12S-2.0),包括之前暴露量較少的小淀粉顆粒(紅色箭頭標記處),表明添加2.0%的茶多酚幾乎完全破壞了面團中蛋白質的網絡結構,變化趨勢同圖12C-2.0,對照組圖12C-0中黃色面筋網絡結構幾乎消失。綜上所述,茶多酚的添加破壞了面筋蛋白網絡的連續性。這同前面實驗中得出的添加茶多酚后增加了面團的自由氨基含量以及還原二硫鍵產生自由巰基并使其結構變得不穩定結論一致。

圖12 面團掃描電鏡圖(1000×)和激光共聚焦顯微鏡圖(200×)Fig.12 Scanning electron micrographs(1000×)and confocal scanning laser microscope(200×)of dough注:S-0、C-0:0%茶多酚添加對照組;S-0.5、C-0.5:0.5%茶多酚;S-1.0、C-1.0:1.0%茶多酚;S-2.0、C-2.0:2.0%茶多酚。

3 結論

本文主要分析在面團中添加茶多酚后其內蛋白質的含量及結構變化以探究茶多酚對面筋蛋白網絡形成過程中的影響及其作用機理。實驗測定結果表明茶多酚的添加在面團加工過程中會影響面筋蛋白網絡結構的形成,增加面團體系內游離氨基和自由巰基的含量并降低其內濕面筋的含量,使蛋白二級結構向無序化轉變和降低二硫鍵的穩定性,并同時使蛋白質中色氨酸殘基逐漸暴露。顯微電鏡圖片也顯示隨著茶多酚的加入,面筋蛋白網絡結構被逐漸破壞。綜上所述,本實驗通過對茶多酚作用于面團中面筋蛋白質結構測定與分析,從多個角度證明了茶多酚的添加會影響面筋蛋白結構形成及結構,有利于更全面理解茶多酚添加在面團加工過程中所起的作用及其機理。