阿膠低聚肽的成分分析及其抗氧化活性

樊雨梅,汝文文,史傳超,鈐莉妍,廖 峰

(國家膠類中藥工程技術研究中心,東阿阿膠股份有限公司,山東聊城 252201)

阿膠(CollaCoriiAsini,CCA)為馬科動物驢(EquusasinusL.)的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠[1],已有2000多年的使用歷史,始載于《神農本草經》。阿膠的主要成分是膠原蛋白、多肽類物質、氨基酸、微量元素和硫酸皮膚素。現在藥理研究表明,阿膠具有治療貧血[2]、輔助治療腫瘤[3]、提高免疫力[4-5]、抗炎[6]和抗衰老[7]等功效。通常認為在阿膠中起主要功效的化學成分是多肽和蛋白質的混合物。目前,阿膠主要的食用方式是經烊化后口服,不僅服用不便,且存在生物利用度較低易產生“滋膩礙胃”的問題。因此,阿膠的二次開發迫在眉睫。

基于阿膠分子量大、生物利用度較低的問題,采用生物酶解技術制備阿膠低聚肽,不僅解決阿膠服用前需烊化的問題,而且能夠提高阿膠的生物利用度,減輕胃腸負擔。已有研究證實,阿膠經酶解產生的生物活性肽,可提升阿膠的藥理作用。劉元濤等[8]研究證實,阿膠經酶解后,增強了提高小鼠免疫力的作用。Wu等[9]研究發現,模擬人體消化過程酶解阿膠得到組分A(<5000 Da)和組分B(5000～8000 Da),2種組分均可刺激貧血小鼠造血,且組分A效果優于組分B。雖然關于小分子阿膠提高免疫力、抗氧化、抗疲勞、止血、補血的作用已有報道,文獻[10-14]研究了阿膠酶解產物治療貧血、抗疲勞、抗氧化、止血、提高免疫力等作用,但是這些研究采用的阿膠酶解產物或是來自實驗室小規模制備,僅顯示分子量大小,或是企業提供,無任何產品相關信息。因此,本文基于前期大量生物酶解工藝及生產工藝優化的基礎,以阿膠為原料制備阿膠低聚肽,表征阿膠低聚肽的氨基酸組成、分子量分布,并比較阿膠低聚肽與阿膠對成纖維細胞氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿膠 批號:1707038,東阿阿膠股份有限;人成纖維細胞(NHDFs) ATCC PCS-201-010,美國生物標準資源中心;木瓜蛋白酶(1.201×106U/g)、胃蛋白酶(3000 U/g)、菠蘿蛋白酶(5.02×105U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;維生素C、1,2-二苦基-2-三硝基苯亞肼(DPPH)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 阿拉丁試劑有限公司;PBS、DEME培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶 Gibco公司;SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所;活性氧檢測試劑盒 上海碧云天生物技術公司;低聚肽標準品 上海寰玉分析儀器科技有限公司;乙腈、鄰苯二甲醛(OPA)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、甲醇、乙腈、氨基酸標準品 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司。

e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司;Hypersil AA-ODS色譜柱(5 μm,200 mm×2.1 mm) 美國Agilent公司;TSKgel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)色譜柱 上海甄準生物科技有限公司;2015SW0006酶標儀 美國Bio-Rad公司;Observer.D1倒置熒光顯微鏡 德國ZEISS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿膠低聚肽化學物質基礎

1.2.1.1 阿膠低聚肽的制備工藝 阿膠低聚肽的酶解制備工藝[15]:阿膠→粉碎→溶解→在設定溫度中保溫(50～55 ℃)→按照比例加入一定量的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶開始酶解→攪拌酶解→酶解結束后沸水滅酶10 min→過120目篩→濃縮→真空干燥→室溫保存備用。

1.2.1.2 常見指標檢測 阿膠低聚肽中水分含量依據GB 5009.3-2016中直接干燥法進行水分測定[16],蛋白質含量利用GB 5009.5-2016中凱氏定氮法進行測定[17],游離氨基酸的測定采用GB/T 5009.124-2016的方法測定[18]。

1.2.1.3 分子量分布的測定 參照GB/T 22729-2008規定的方法進行測定[19]。

1.2.2 清除自由基實驗

1.2.2.1 DPPH自由基清除率測定 取 0.5 mL待測溶液,加入 0.5 mL 的DPPH乙醇溶液,充分混勻后,將反應體系置于室溫,避光反應20 min。反應結束后,依次取反應液200 μL加入96孔板,于517 nm下讀取吸光度OD值,按照下式計算樣品對DPPH自由基的清除率。每個樣品重復三次。

DPPH自由基清除率(%)=[(C1-C2)-(T1-T2)]/(C1-C2)×100

式中:C1:空白有DPPH體系吸光度值;C2:空白無DPPH體系吸光度值;T1:樣品組有DPPH體系吸光度值;T2:樣品組無DPPH體系吸光度值。

1.2.2.2 ABTS自由基清除率測定 取 10 μL 待測溶液,加入0.2 mL ABTS 溶液,搖勻后,室溫孵育2～6 min后,于734 nm下讀取吸光度OD值,按照下式計算樣品對ABTS自由基的清除率。每個樣品重復三次。

ABTS自由基清除率(%)=[(C1-C2)-(T1-T2)]/(C1-C2)×100

式中:C1:空白有ABTS體系吸光度值;C2:空白無ABTS體系吸光度值;T1:樣品組有ABTS體系吸光度值;T2:樣品組無ABTS體系吸光度值。

1.2.3 阿膠低聚肽對氧化損傷成纖維細胞的抑制作用

1.2.3.1 細胞存活率的影響 在96孔板的每個孔中加入0.1 mL密度為1×105cell/mL的成纖維細胞懸液,即1×104cell/well。于37 ℃、5% CO2、濕潤條件下培養24 h,直至細胞生長至60%。去除培養液,用預溫的PBS輕洗兩次。去除清洗液,加入0.1 mL含適當濃度阿膠、阿膠低聚肽、溶劑(空白對照)的培養基,實驗設置阿膠組、阿膠低聚肽組、空白對照組、模型對照組。37 ℃、5% CO2、濕潤條件下繼續培養24 h。將各孔細胞培養上清液吸出,加入100 μL 150 μmol/L H2O2作用100 min,然后用CCK-8測定細胞活性。

1.2.3.2 細胞內ROS水平檢測 按照4×105cell/well接種至6孔細胞培養板中,同1.2.3.1分組及預處理細胞后,采用活性氧檢測試劑盒檢測各組細胞二氯二氫熒光素(DCF)熒光強度,用熒光顯微鏡拍照觀察,激發光波長為488 nm,發射波長為525 nm。

1.2.3.3 SOD水平的測定 同1.2.3.1分組及預處理后,分別采用SOD試劑盒和BCA試劑盒檢測各組細胞SOD活性和細胞蛋白濃度,按照各說明書的公式計算各組SOD活性和細胞蛋白濃度。

1.3 數據處理

應用GraphPad Prism 7軟件進行數據分析與繪圖,實驗重復3次,結果以“均數±標準差”表示。多重數據差異比較采用方差分析,兩組間差異比較采用t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 阿膠低聚肽的成分分析

2.1.1 阿膠低聚肽的常見指標 采用復合蛋白酶酶解制得的阿膠低聚肽呈淺棕色至棕色粉狀,具有膠香味、味微苦、無異味,無肉眼可見雜質。采用國標方法測定阿膠低聚肽水分和蛋白的含量,分別為6.72和94.00 g/100 g。阿膠低聚肽的蛋白含量顯著高于阿膠蛋白含量74.56～84.94 g/100 g[20]。

阿膠低聚肽中游離氨基酸組成和含量見表1。阿膠低聚肽中游離氨基酸的總量為79.06 g/100 g,介于阿膠中氨基酸的含量30.14～87.07 g/100 g[21-25]。阿膠低聚肽富含人體必需的8種氨基酸和2種半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸),占氨基酸總量的28.62%。阿膠低聚肽的氨基酸組成中具有給質子能力的氨基酸占59.95%,具有很強穩定自由基的能力。疏水性氨基酸是影響多肽抗氧化能力的關鍵因素,疏水性氨基酸含量越高,抗氧化能力越強[26]。阿膠低聚肽疏水性氨基酸占氨基酸總量的46.23%,可為阿膠低聚肽提供疏水環境,促進清除脂相產生的自由基。氨基酸組成是小肽轉運的決定因素之一,疏水性比較大的氨基酸構成的肽,與載體具有較高的親和力,較易吸收[27]。阿膠低聚肽疏水性氨基酸含量較高,有助于阿膠低聚肽被機體吸收利用,可提高阿膠體內的抗氧化活性。

表1 阿膠低聚肽的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition and contents of Colla Corii Asini oligopeptides

2.1.2 阿膠低聚肽的分子量分布 采用高效液相色譜法測定阿膠低聚肽的分子量分布,分子量分布計算結果如表2所示。阿膠低聚肽屬于小分子混合物,分子量900 Da以上的僅占16.12%,分子量900 Da以下的高達83.87%,其中主要集中在500 Da以下。大量研究報道,分子量越小,抗氧化能力越強[28-29]。阿膠低聚肽的分子量主要集中在900 Da以下,推測阿膠低聚肽的抗氧化能力較強。

表2 阿膠低聚肽的分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of Colla Corii Asini oligopeptides

食物中蛋白質在胃腸道消化酶的作用下,最后大多以游離氨基酸和小肽的形式被完整的吸收[30]。且在臨床營養支持中,小肽的吸收形式優于相應的氨基酸[27]。分子量900 Da以下多為2～4個氨基酸組成的小分子肽,因此,推測阿膠低聚肽具有良好的吸收效率。

2.2 阿膠低聚肽體外抗氧化活性的測定

2.2.1 阿膠低聚肽清除自由基的能力

2.2.1.1 DPPH自由基清除能力 阿膠和阿膠低聚肽的DPPH自由基清除率見圖1。阿膠和阿膠低聚肽清除DPPH自由基的趨勢相同:在濃度0～5 mg/mL之間具有量效關系,且具有統計學顯著性差異;在5～20 mg/mL范圍內無明顯量效關系,且無統計學差異性。在濃度為10 mg/mL時,阿膠和阿膠低聚肽清除DPPH自由基的能力最高,分別為90.13%±0.17%和93.45%±0.27%。所有同等劑量下阿膠低聚肽溶液的DPPH自由基清除率均高于阿膠溶液,這與Wu[10]等的結果一致。鄭淋[31]總結具有活性的262個抗氧化肽的肽段序列、活性評價方法等信息,發現抗氧化肽的抗氧化活性可能與其序列中含有的能供電子或氫能力的氨基酸殘基(組氨酸、酪氨酸、色氨酸和蛋氨酸等)、具有螯合金屬離子的酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和疏水性氨基酸殘基有關。也有研究發現,疏水性氨基酸在對抗脂質過氧化反應有重要的作用,脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸與自由基的清除能力有關[32]。經過計算,阿膠低聚肽的供電子或氫能力的氨基酸和螯合金屬離子的酸性氨基酸占總氨基酸的比例分別為2.46%和19.06%,高于阿膠的比例(分別是2%、17.32%[21-25])。另外,阿膠和阿膠低聚肽的半抑制濃度(IC50)分別為1.89和1.39 mg/mL,顯著低于李笑塵等[33]報道的3.0 g/L。

圖1 阿膠和阿膠低聚肽的DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging activity of Colla Corii Asini and Colla Corii Asini oligopeptides

2.2.1.2 ABTS自由基清除能力 阿膠和阿膠低聚肽的ABTS自由基清除率見圖2。阿膠和阿膠低聚肽具有清除ABTS自由基的功效,在濃度0～2.0 mg/mL范圍內具有量效關系,且具有統計學顯著性差異。經過計算,阿膠的IC50為3.33 mg/mL,與Zhang等[34]報道的阿膠IC50為2.859 g/L一致,表明實驗結果準確可靠。由圖2可知,所有同等劑量下阿膠低聚肽溶液的ABTS自由基清除率均高于阿膠溶液。已有研究表明,蛋白原料的酶解產物在ABTS法中的抗氧化活性與其蛋白原料中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等抗氧化氨基酸的含量高度相關[31]。阿膠低聚肽酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸等抗氧化氨基酸的含量為1.79 g/100 g,介于阿膠抗氧化氨基酸的含量1.70～3.80 g/100 g。Rajapakse等[35]報道,天冬氨酸在一些抗氧化肽中發揮著重要的作用,且與其在肽段中的位置無關。阿膠低聚肽中天冬氨酸含量為5.15 g/100 g,阿膠中天冬氨酸含量為1.83～5.20 g/100 g。可見,氨基酸的組成僅能部分解釋阿膠低聚肽抗氧化活性優于阿膠,需進一步研究氨基酸的序列以解釋阿膠與阿膠低聚肽抗氧化的活性。經過計算,阿膠低聚肽的IC50為2.06 mg/mL,高于李笑塵等[33]報道的0.7 g/L。

圖2 阿膠和阿膠低聚肽的ABTS自由基清除能力Fig.2 ABTS+ radical scavenging activity of Colla Corii Asini and Colla Corii Asini oligopeptides

2.2.2 阿膠低聚肽對氧化損傷成纖維細胞的抑制作用

2.2.2.1 細胞存活率的影響 用H2O2處理成纖維細胞后,細胞的增殖活性明顯降低,細胞存活率降低至47.18%,與凌玉芳等[36]的報道一致。阿膠和阿膠低聚肽防護H2O2造成的細胞氧化損傷結果見圖3。阿膠和阿膠低聚肽防護H2O2誘導成纖維細胞氧化損傷趨勢相同,但各濃度阿膠低聚肽的效果顯著優于阿膠(P<0.01),與劉元濤等[8]、Wu等[9-10]報道的阿膠經酶解后,可提高阿膠的藥理活性結論一致。與模型組相比,1%阿膠、0.5%與1.0%阿膠低聚肽預處理均可顯著提高成纖維細胞的增殖活性。

圖3 阿膠和阿膠低聚肽對H2O2誘導NHDFs細胞存活率的影響Fig.3 Effects of Colla Corii Asini and Colla Corii Asini oligopeptides on the survival rate of NHDFs cells induced by H2O2注:與阿膠組相比,*表示差異顯著,P<0.05;**表示差異極顯著,P<0.01;“+”表示加入藥物,“-”表示不加入藥物。

2.2.2.2 細胞內ROS水平檢測 利用DCFH-DA法檢測阿膠和阿膠低聚肽對成纖維細胞內ROS清除能力的影響,結果見圖4。與空白對照組(圖4a)相比,H2O2模型組(圖4b)熒光強度高,損傷明顯。接受阿膠處理的H2O2損傷后成纖維細胞在熒光顯微鏡下觀察到少部分細胞表達出較高的熒光(圖4c),與H2O2模型組相比,表達高熒光的細胞數量及熒光輕度明顯減少,且阿膠低聚肽的效果優于阿膠。

圖4 ROS含量的變化Fig.4 Changes of ROS content in NHDFs cells

2.2.2.3 SOD水平的測定 SOD作為一種主要的抗氧化酶,可有效清除超氧陰離子,SOD水平高低可間接反映組織自由基的含量和細胞受損程度。本研究測定成纖維細胞中SOD的活力水平,以考察阿膠和阿膠低聚肽對H2O2造成成纖維細胞氧化損傷的防護效果。由表3可知,與模型組相比,10 mg/mL的阿膠和阿膠低聚肽組的SOD活力分別升高148.72和415.88 U/mg prot,差異均具有統計學意義(P<0.01)。阿膠低聚肽升高SOD水平是阿膠的115.03%,可見雖然阿膠能夠提高氧化損傷細胞的SOD活性,但阿膠低聚肽的效果更佳。

表3 阿膠和阿膠低聚肽對H2O2誘導NHDFs細胞SOD活性的影響Table 3 Effects of Colla Corii Asini and Colla Corii Asini oligopeptides on SOD in NHDFs induced by H2O2

3 結論

本研究首次對阿膠低聚肽進行較為全面的成分分析及體外防護H2O2造成氧化損傷效果的測定,并將阿膠低聚肽與阿膠體外抗氧化活性進行對比分析。以阿膠為原料,通過復合酶解法獲得阿膠低聚肽。阿膠低聚肽氨基酸種類齊全,含有人體必需的8種氨基酸和2種半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸),且富含疏水性氨基酸,占氨基酸總量的46.23%,使得阿膠低聚肽抗氧化性增高。阿膠低聚肽主要成分為900 Da以下的小分子肽,易于被人體吸收。從清除DPPH、ABTS自由基和防護H2O2造成成纖維細胞氧化損傷等方面,分析阿膠與阿膠低聚肽體外抗氧化活性的差異。結果表明,阿膠和阿膠低聚肽可能通過增加細胞增殖活性、清除自由基、提高抗氧化酶活性等方面發揮對H2O2誘導成纖維細胞氧化損傷的防護作用,但阿膠低聚肽的效果優于阿膠。實驗結果不僅為下一階段篩選阿膠相關功能特征肽段,明確阿膠抗氧化分子機制奠定了良好的基礎,也為阿膠方便服用和相關抗氧化保健食品的開發利用提供了一定的理論支持。