水熱糖基化大米蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及溶解性研究

李靈誠(chéng),李兵兵,夏 寧,滕建文,黃 麗,韋保耀,董傳志

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

大米蛋白質(zhì)(Rice protein,RP)是營(yíng)養(yǎng)界所公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物蛋白,氨基酸組成合理、具有高生物價(jià)、低過(guò)敏性以及抗腫瘤活性等特性[1],近年來(lái)受到廣泛的關(guān)注與應(yīng)用。大米蛋白質(zhì)中含有不同類型的蛋白質(zhì),其中超過(guò)80%是谷蛋白,但由于大米蛋白質(zhì)的溶解性等功能特性較差,在食品中的應(yīng)用受到限制[2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于提高蛋白質(zhì)溶解性的改性方法主要集中在酶法、化學(xué)法、物理法和基因工程法,其中化學(xué)法改善蛋白質(zhì)的功能特性較為顯著,常用的化學(xué)法有酸化、磷酸化、酯化、酰化和糖基化等[2-4]。其中糖基化改性由于反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行的,無(wú)需要添加其他的化學(xué)物質(zhì),被認(rèn)為是改善食品蛋白質(zhì)功能特性的一種最為廣泛的方法。它可將糖類物質(zhì)的親水基團(tuán)以共價(jià)連接的方式接枝到蛋白質(zhì)分子上,使修飾的糖基化產(chǎn)物一方面具有蛋白質(zhì)的大分子特性,另一方面也具有糖類物質(zhì)的親水特性,能有效的提高大米蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[5]。

目前,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道糖基化反應(yīng)主要分為三個(gè)階段,即早期、中期和晚期,所有階段同時(shí)發(fā)生且相互關(guān)聯(lián)[6]。此外,糖基化反應(yīng)的所有階段都受反應(yīng)參數(shù)的影響,包括水分活度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、體系pH、蛋白與糖的組成、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)等,其中使用的糖主要是葡萄糖與蔗糖等[7]。糖基化反應(yīng)方法主要分為兩種,目前采用的糖基化方法主要包括干熱法和濕熱法。干熱法的反應(yīng)條件比較溫和,產(chǎn)物功能特性較好,但是反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng),反應(yīng)條件較為嚴(yán)格;濕熱法由于反應(yīng)體系中水分活度和加熱強(qiáng)度方面明顯高于干熱法,使得蛋白質(zhì)分子和糖分子互相碰撞接觸的機(jī)會(huì)增加,有利于反應(yīng)的進(jìn)行[8]。而本文使用的水熱處理(HTC),又稱噴射蒸煮技術(shù),能使蛋白質(zhì)生成可溶性聚集體[9]。通常使難溶或不溶的物質(zhì)溶解和重結(jié)晶[10]。目前,國(guó)內(nèi)外研究表明可利用水熱技術(shù)提高蛋白質(zhì)提取效率和改善蛋白質(zhì)的功能特性[11]該技術(shù)已經(jīng)有被應(yīng)用到大豆蛋白糖基化的研究中,并且該技術(shù)相比于傳統(tǒng)的干法和濕法糖基化改性方法,耗時(shí)更短,反應(yīng)進(jìn)程更快,接枝度更高,并且高級(jí)階段產(chǎn)物更少[12],高級(jí)階段的終末產(chǎn)物(AGEs)在人體內(nèi)累積會(huì)影響健康[13],但水熱技術(shù)在大米蛋白質(zhì)與木糖糖基化改性的應(yīng)用還未見報(bào)道。D-木糖是一種天然小分子還原糖,無(wú)毒,末端碳原子上的醛基易于與氨基發(fā)生美拉德反應(yīng),還能獲得較高抗氧化活性的糖基化反應(yīng)產(chǎn)物[14]。

基于此,本試驗(yàn)選擇大米蛋白質(zhì)與木糖進(jìn)行水熱糖基化處理(120 ℃),以期在促進(jìn)大米蛋白質(zhì)溶解性的基礎(chǔ)上,增加RP與木糖的接枝度,并對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間、pH、蛋白質(zhì)與糖的質(zhì)量比的條件下,水熱糖基化改性前后的大米蛋白質(zhì)接枝度、結(jié)構(gòu)及溶解性進(jìn)行了初步的研究,以期為功能性大米糖蛋白的加工生產(chǎn)提供理論依據(jù)拓展大米蛋白的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米(珍桂米) 市售;木糖(≥99%) 北京索萊寶科技有限公司;鄰苯二甲醛(OPA) 源葉生物有限公司;酒石酸鉀鈉、四硼酸鈉(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉、溴化鉀、鹽酸(分析純) 成都金山化學(xué)試劑有限公司;甲醇(分析純) 成都市科隆化學(xué)品有限公司;無(wú)水碳酸鈉(≥99.8%)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀(分析純) 天津博迪化工股份有限公司;Folin-酚、牛血清白蛋白、甘氨酸、SDS 北京索萊寶科技有限公司;β-巰基乙醇 Sigma-Aldrich公司。

手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;TLE204E分析天平、pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;TECAN酶標(biāo)儀 上海勒菲生物科技有限公司;RW16電子攪拌機(jī) 德國(guó) IKA 公司;ST-16R離心機(jī) 費(fèi)默爾科技(中國(guó))有限公司;S25磁力攪拌機(jī) 德國(guó) IKA 公司;真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST儀器有限公司;L-8900高速氨基酸分析儀 日本HITACHI公司;Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀 美國(guó)熱電公司;RF-5301PC熒光分光光度計(jì)、UV-1601紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水熱法制備RP-木糖糖基化產(chǎn)物 大米與正己烷按照1∶3 (w/V)采用索氏抽提法去除脂肪,30 ℃低溫烘干。稱取一定量脫脂大米與純水按質(zhì)量比1∶10 (w/w)混合、浸泡、打漿,用2 mol/L NaOH調(diào)至pH10,室溫?cái)嚢? h后,4000 r/min離心20 min,取上清液,將上清液用2 mol/L HCl調(diào)至pH4.8 進(jìn)行酸沉,4 ℃靜止24 h,經(jīng)4000 r/min離心20 min,水洗沉淀,調(diào)至pH中性后進(jìn)行透析、凍干。由凱氏定氮方法測(cè)得RP的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%。

稱取一定量RP溶于濃度50 mmol/L 的磷酸緩沖液(pH11)至設(shè)定的蛋白質(zhì)量濃度為1%,50 ℃下磁力攪拌30 min,經(jīng)冷卻,在120 ℃的高溫蒸汽下,固定體系pH為8,木糖與RP質(zhì)量比為5∶1,反應(yīng)時(shí)間分別為10、15、20、25、30 min,固定反應(yīng)時(shí)間為20 min,木糖與RP質(zhì)量比為5∶1,調(diào)節(jié)體系pH為6、7、8、9、10,固定反應(yīng)時(shí)間為20 min,體系pH為8,加入一定質(zhì)量比的木糖(木糖∶RP=1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1),熱處理后,樣品冰浴冷卻備用,考察對(duì)接枝度和溶解度的影響。其余指標(biāo)使用上清液凍干粉末(RP-木糖糖基化產(chǎn)物)分析。

1.2.2 接枝度測(cè)定 OPA試劑的配制:稱取40 mg的OPA溶解于1 mL的甲醇中,依次加入20% SDS溶液 2.5 mL,0.1 mol/L的硼砂溶液25 mL,100 μLβ-巰基乙醇,定容至50 mL。

樣品測(cè)定:吸取200 μL RP-木糖糖基化產(chǎn)物溶液加入所配試劑4 mL于試管中,混勻,于35 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 min,340 nm測(cè)其吸光值A(chǔ)1,相同條件下200 μL RP溶液吸光值為空白樣測(cè)定吸光值A(chǔ)0,二者之差ΔA為自由氨基的凈吸光值[15],通過(guò)OPA測(cè)定獲得反應(yīng)前后的游離氨基酸含量的降低來(lái)表明糖基化反應(yīng)的發(fā)生。

1.2.3 溶解度測(cè)定 采用福林(Folin)-酚試劑法測(cè)定上清液中溶解的蛋白質(zhì)含量[16],凱氏定氮法測(cè)總蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 氨基酸分析 制備得到的RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物的氨基酸組成與含量,采用國(guó)標(biāo)GB 5009.124-2016進(jìn)行測(cè)定[17]。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 根據(jù)Laemmli[18]報(bào)道的方法,采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳,分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為2%。分別稱取2 mg的RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物,加入500 μL電泳緩沖液,沸水煮5 min。上樣量10 μL,凝膠電泳于恒流下進(jìn)行,樣品在濃縮膠中時(shí)電壓設(shè)定為80 V,進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)為120 V。電泳完成后凝膠采用考馬斯亮藍(lán)法(R-250)染色1 h,染色后于脫色液中脫色2 d,脫色完成后膠片拍照分析。

1.2.6 紫外光譜分析 RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物分散于pbs(pH7.0,50 mmol/L)緩沖溶液中,濃度為1 mg/mL。在紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描,波長(zhǎng)范圍:200～600 nm[19]。

1.2.7 熒光光譜分析 內(nèi)源熒光光譜:RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物分散于50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)中,蛋白濃度為 0.2 mg/mL。取上清液3 mL,在掃描發(fā)射光譜為300～500 nm,激發(fā)波長(zhǎng)290 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm[9],磷酸緩沖液的熒光光譜作為空白對(duì)照。

糖熒光光譜RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物分散于10 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中,蛋白濃度為1 mg/mL。取上清液3 mL,熒光光譜在334 nm激發(fā),掃描發(fā)散光譜為350～550 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm,磷酸緩沖液的熒光光譜作為空白對(duì)照[9]。

1.2.8 紅外光譜分析 分別取1 mg RP,RP-木糖糖基化產(chǎn)物凍干樣品粉末,加入100 mg 溴化鉀,共混、研細(xì)、壓片,采用紅外光譜儀在4000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 22進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,Oringin 8.6軟件作圖以及紅外數(shù)據(jù)處理,OMNIC軟件進(jìn)行紅外數(shù)據(jù)處理,Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物接枝度及溶解度的影響

從圖1可知,RP在沒有添加木糖的水熱作用下,溶解度均低于13%,這是由于在水熱情況下,蛋白發(fā)生熱變形,降低其表面親水性,使得溶解度一直處于較低水平[21]。但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),有利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行,大米蛋白質(zhì)與木糖發(fā)生糖基化反應(yīng),其接枝度和溶解度逐漸增加,反應(yīng)20 min時(shí)達(dá)到最高值,分別為42.47%與26.07%,隨后均出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能與反應(yīng)初期暴露在蛋白質(zhì)表面的游離氨基可以較快的與木糖反應(yīng),引入糖基,增加蛋白的親水性質(zhì);但隨著加熱時(shí)間繼續(xù)增加,蛋白更多的內(nèi)部氨基來(lái)參與反應(yīng),但此時(shí)已經(jīng)糖基化的蛋白質(zhì)有可能再次發(fā)生聚合,從而使接枝度與溶解度在20 min后略有降低[22-23]。

2.2 不同pH對(duì)糖基化產(chǎn)物接枝度及溶解度的影響

由圖2B看出,隨pH增大RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物溶解度增大,pH10時(shí)分別達(dá)到28.3%和35.5%,在pH8時(shí)溶解度由11.35%到27.1%增加了15.7%,增加值最大。可以看出pH對(duì)溶解度的影響>接枝度對(duì)溶解性的影響,但在食品加工以及保存過(guò)程中,極少使其pH高于8。

圖2 不同pH對(duì)糖基化產(chǎn)物接枝度(A)及溶解度(B)的影響Fig.2 Effect of different pH on grafting degree(A)and solubility(B)

pH6～8接枝度隨pH增加增加,這是因?yàn)?在酸性條件下氨基是離子化的銨離子,反應(yīng)活性低,并且在酸性條件下蛋白的溶解度本身也比較低,當(dāng)pH8時(shí)達(dá)到最大41.94%,pH為9時(shí)接枝度有所下降,pH10時(shí)接枝度又開始上升。糖基化反應(yīng)本質(zhì)上是堿催化反應(yīng),因此pH偏向堿性有利于反應(yīng)的進(jìn)行。但是堿性過(guò)強(qiáng),蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化,如脫氨脫羧和肽鍵斷裂,引起的“胱賴反應(yīng)”將氨基酸轉(zhuǎn)化為有毒的化合物,反而不利于接枝反應(yīng)的進(jìn)行[24]。

2.3 木糖與RP不同質(zhì)量比對(duì)糖基化產(chǎn)物接枝度及溶解度的影響

由圖3,隨著木糖質(zhì)量比的增加溶解度和接枝度都是呈現(xiàn)先上升至最大值后下降的趨勢(shì),接枝度與溶解度成正比,木糖與RP質(zhì)量比為7∶1時(shí)溶解度到達(dá)最大27.62%,此時(shí)接枝度也達(dá)到最大值46.50%。這由于RP與木糖的比例在達(dá)到最佳值之后,如果繼續(xù)增加木糖的量那么會(huì)使溶液的黏度上升,從而使得分子的流動(dòng)性變差[25-26]。與此同時(shí),由于大分子的空間穩(wěn)定作用,使得反應(yīng)位點(diǎn)不容易靠近,所以接枝度在上升達(dá)到最高值后反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

圖3 木糖與RP不同質(zhì)量比對(duì)糖基化產(chǎn)物接枝度(A)及溶解度(B)的影響Fig.3 Effect of different ratios of xylose and protein on grafting(A)degree and solubility(B)

通過(guò)對(duì)水熱反應(yīng)的時(shí)間、溫度、pH及木糖與RP質(zhì)量比的研究中,以接枝度為評(píng)判指標(biāo),得出RP與木糖的較優(yōu)的反應(yīng)條件為:水熱溫度120 ℃,水熱時(shí)間為20 min,pH為8,木糖與蛋白質(zhì)量比為7∶1,接枝度達(dá)到最大46.50%,RP-木糖糖基化產(chǎn)物溶解度達(dá)到27.62%是RP的2.38倍,在此條件下制備糖基化產(chǎn)物,并進(jìn)一步分析產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化。

2.4 氨基酸組成分析

對(duì)RP、RP-木糖糖基化產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸分析,結(jié)果見表1。通過(guò)對(duì)氨基酸含量進(jìn)行分析,大米蛋白質(zhì)中主要的氨基酸為谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)與亮氨酸(Leu)。在糖基化反應(yīng)過(guò)程中,大米蛋白質(zhì)氨基酸中主要是賴氨酸和精氨酸的相對(duì)含量減少,分別從6.04與7.66降低到2.99與5.77,這是由于賴氨酸和精氨酸的側(cè)鏈上存在自由氨基,參與了RP和木糖的糖基化反應(yīng)。在表中也同時(shí)發(fā)現(xiàn),酪氨酸、半胱氨酸與甲硫氨酸的相對(duì)含量也有較為明顯的降低,這表明半胱氨酸也參與到接枝反應(yīng)中,含量降低的原因則可能是由于其側(cè)鏈中存在硫醇和羥基,其可與糖分子發(fā)生反應(yīng)[27]。

表1 RP、RP-木糖糖基化產(chǎn)物的氨基酸的組成(g/100 g氨基酸)Table 1 Amino acid compositions of RP,RP-xylose(g/100 g amino acid)

2.5 SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE是判斷蛋白中以共價(jià)鍵結(jié)合糖的重要手段,也可以驗(yàn)證添加木糖對(duì)大米蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及組成產(chǎn)生的變化,對(duì)RP及RP-木糖糖基化產(chǎn)物的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,其還原與非還原條件下的電泳圖譜如圖4所示。從圖中可以看出RP(1)的主要成分為谷蛋白,其中包括相對(duì)分子量為51 kDa的谷蛋白聚肽、34～37 kDa與21～22 kDa的谷蛋白酸性亞基和堿性亞基以及26 kDa的球蛋白亞基[28]。在還原條件下,經(jīng)過(guò)β-巰基乙醇處理后,濃縮膠頂部高分子量的蛋白聚集體以及大部分谷蛋白聚肽會(huì)被還原成小分子量的肽,所以RP對(duì)應(yīng)的谷蛋白的酸性亞基與堿性亞基條帶的光密度明顯增強(qiáng),這與RP中的二硫鍵的斷裂有關(guān)。而在非還原條件下RP(泳道3)在濃縮膠頂部富含以共價(jià)的二硫鍵結(jié)合的高分子量的蛋白聚集體、分離膠上有谷蛋白聚肽、球蛋白、谷蛋白酸性亞基及谷蛋白堿性亞基的形式[29],且谷蛋白聚肽的含量明顯高于還原條件下的含量。RP-木糖(泳道2與泳道4)糖基化產(chǎn)物在還原和非還原條件下都顯示出比較連續(xù)的條帶特征,缺乏明顯的谷蛋白聚肽、球蛋白亞基和谷蛋白堿性亞基,說(shuō)明這些亞基有可能參與到與木糖的糖基化反應(yīng)中,生成分子量較大的結(jié)合物,在濃縮膠頂部顯示出大量聚集體,與RP在β-巰基乙醇的作用下聚集體幾乎降解不同,這種聚集體在β-巰基乙醇的作用下的還原電泳條帶中,較難發(fā)生分解(泳道2),這說(shuō)明RP與木糖發(fā)生糖基化反應(yīng)生成了不同的RP-木糖高分子量聚集體[30-31]。

圖4 RP與RP-木糖糖基化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE mapping of RP and RP-xylose注:其中泳道1、泳道2為還原條件下RP、RP-木糖糖基化產(chǎn)物;泳道3、泳道4為非還原條件下RP、RP-木糖糖基化產(chǎn)物;Maker為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

2.6 紫外光譜分析

從圖5可知,由于RP中的芳香族氨基酸酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及苯丙氨酸(Phe)殘基在225與280 nm波長(zhǎng)下也能吸收一定波長(zhǎng)的紫外光[32],同時(shí)糖基化產(chǎn)物羥甲基糠醛在280 nm附近也有紫外吸收[33]。但是添加木糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)后,這兩個(gè)最大吸收峰沒有明顯的紅移或藍(lán)移,說(shuō)明蛋白肽鏈中的酪氨酸和色氨酸微環(huán)境極性沒有明顯改變[12],而水熱糖基化后的RP-木糖在280 nm附近的紫外吸收值明顯高于RP的紫外吸收[34]。這可能是由于水熱糖基化使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化,疏水基團(tuán)暴露而使芳香族氨基酸的紫外吸收增大,結(jié)合氨基酸分析表1可知,酪氨酸(Tyr)的含量下降,苯丙氨酸(Phe)的含量增加,但增加量只有0.89%;同時(shí)糖基化產(chǎn)物的產(chǎn)生也是一個(gè)重要原因,說(shuō)明糖基化產(chǎn)物羥甲基糠醛是導(dǎo)致紫外吸收增加的主要物質(zhì)[33]。在280～320 nm之間新增了一個(gè)吸收峰,這可能是糖基化反應(yīng)的過(guò)程中,一方面糖會(huì)發(fā)生異構(gòu)和脫水,產(chǎn)生糠醛類物質(zhì),在 290 nm 左右有特征吸收;另一方面,用木糖糖基化修飾RP,生成了一些糖基化高級(jí)階段產(chǎn)物,并在290 nm左右形成了具有顯著吸光特性的生色團(tuán),增加了吸光值,這是美拉德反應(yīng)的特征[35]。

圖5 RP與RP-木糖糖基化產(chǎn)物的紫外光譜Fig.5 UV spectrum of RP and RP-xylose

2.7 熒光光譜分析

在290 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下,色氨酸為發(fā)射基團(tuán)的熒光光譜,通過(guò)對(duì)蛋白中的色氨酸微環(huán)境的極性改變來(lái)反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[36]。通常,如果色氨酸最大熒光發(fā)射峰(λmax)<330 nm,則色氨酸被指定為埋藏在“非極性”環(huán)境中;如果λmax>330 nm,則色氨酸被指定為處于“極性”環(huán)境中[37],因此,從圖6可見,本研究中的RP的色氨酸基團(tuán)存在于“極性”環(huán)境中,而隨著木糖的加入,RP-木糖的熒光發(fā)射峰的峰形保持不變,但是熒光發(fā)射強(qiáng)度發(fā)生猝滅,這可能是由于糖鏈的產(chǎn)生對(duì)蛋白造成屏蔽效果[30]。此外,RP-木糖糖基化產(chǎn)物的λmax從351 nm增加到362 nm,發(fā)生了紅移,熒光波長(zhǎng)紅移及熒光強(qiáng)度淬滅結(jié)果表明木糖和大米蛋白質(zhì)分子之間可能發(fā)生了相互作用。當(dāng)最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移,表明蛋白內(nèi)部的色氨酸發(fā)射基團(tuán)位于更為親水的微環(huán)境中[38],這可能與RP-木糖在水熱糖基化過(guò)程中,一方面由于受到高溫高濕條件的影響,原來(lái)在熱穩(wěn)定過(guò)程中以二硫鍵形成的緊密的蛋白聚集體分子展開,暴露出更多的親水基團(tuán)[9],另一方面由于糖分子的中的羥基作為極性基團(tuán)的引入。

圖6 RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物熒光掃描圖譜Fig.6 Fluorescence spectrum of complexes of RP and RP-xylose

蛋白質(zhì)與糖發(fā)生糖基化反應(yīng)會(huì)生成有色物質(zhì),而熒光物質(zhì)是有色物質(zhì)的前體物[39],采用334 nm作為激發(fā)波長(zhǎng),通過(guò)對(duì)糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度與熒光光譜掃描來(lái)判斷糖基化反應(yīng)的強(qiáng)度[9],得到圖7所示的糖熒光光譜掃描圖,RP-木糖在419 nm處有最大熒光強(qiáng)度,RP在此波長(zhǎng)下沒有熒光發(fā)射峰,由此推斷糖基化反應(yīng)的發(fā)生,以及有色物質(zhì)形成可能是由于低分子量化合物的形成和高分子量類黑精的存在[39]。

圖7 RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物糖熒光掃描圖譜Fig.7 Fluorescence spectrum of complexes of RP and RP-xylose

2.8 紅外光譜分析

紅外光譜是一種常用的分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法,能夠通過(guò)蛋白在中紅外區(qū)有若干特征吸收峰,靈敏地反映出肽鏈結(jié)構(gòu)的變化[40]。圖8是RP和RP-木糖糖基化產(chǎn)物的紅外光譜圖,從圖可以發(fā)現(xiàn)RP-木糖糖基化產(chǎn)物在3700～3200 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)光譜強(qiáng)度增強(qiáng)(即透光率下降),由于此波長(zhǎng)范圍內(nèi)主要是由于游離-OH 的伸縮振動(dòng)引起透過(guò)率的減少,這表明 RP發(fā)生糖基化反應(yīng)后,糖分子以共價(jià)鍵形式接入RP中,使-OH的數(shù)量增多[20]。蛋白質(zhì)的紅外光譜圖譜有幾組特征吸收譜帶:酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶,其波長(zhǎng)分別對(duì)應(yīng)于1600～1700、1530～1550 cm-1波數(shù)范圍[41],紅外光譜測(cè)定的酰胺Ⅰ帶里可以計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)含量,取酰胺Ⅰ帶的范圍進(jìn)行計(jì)算,進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理,并運(yùn)用高斯擬合,各二級(jí)結(jié)構(gòu)的峰面積與酰胺Ⅰ帶總峰面積的比值為二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量見表2。其中特征吸收譜帶酰胺Ⅰ帶(主要C=O為伸縮振動(dòng))能夠反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲等)的變化,其中α-螺旋主要表現(xiàn)在1650～1 660 cm-1、β-折疊在1618～1640和1670～1690 cm-1、β-轉(zhuǎn)角在1660～1670和1690～1700 cm-1、無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在1640～1650 cm-1區(qū)域內(nèi)[42-43]。因此,表2中RP-木糖與RP相比,α-螺旋和β-折疊有顯著降低分別降低了2.15%和3.14%,α-螺旋主要在RP分子的內(nèi)部,含量的減少說(shuō)明蛋白質(zhì)分子間氫鍵被破壞,使得蛋白中的游離氨基與糖類發(fā)生-接枝反應(yīng)[42-43]。無(wú)規(guī)則卷曲含量顯著增加,從8.74%到18.14%,說(shuō)明部分α-螺旋和β-折疊轉(zhuǎn)化為了無(wú)規(guī)則卷曲,β-轉(zhuǎn)角無(wú)明顯變化,進(jìn)一步說(shuō)明水熱糖基化后的RP的結(jié)構(gòu)更加松散[44]。由圖8,酰胺譜Ⅱ帶能靈敏地反映分子間或分子內(nèi)的氫鍵締合作用,水熱糖基化反應(yīng)破壞了這些為蛋白分子提供穩(wěn)定性的作用力,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為靈活[45]。1000～1070 cm-1吸收峰是糖分子中C-O-C官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)和糖環(huán)存在的典型特征[46],從圖中也可以看出RP-木糖糖基化產(chǎn)物的紅外光譜在1050 cm-1吸收峰處明顯的吸收強(qiáng)度,表明木糖分子與RP發(fā)生了糖基化反應(yīng),引入了相應(yīng)的功能性基團(tuán),導(dǎo)致蛋白分子側(cè)鏈振動(dòng)[20]。

表2 RP與RP-木糖糖基化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 2 Secondary structural contents of RP and RP-xylose

圖8 RP與 RP-木糖糖基化產(chǎn)物的FIIR圖Fig.8 FTIR spectra of RP and RP-xylose

3 結(jié)論

通過(guò)研究水熱糖基化改性對(duì)大米蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及溶解性的影響,得到結(jié)論當(dāng)反應(yīng)溫度為120 ℃,反應(yīng)時(shí)間20 min,pH8,木糖與RP質(zhì)量比7∶1時(shí),接枝度達(dá)到最大46.50%,RP-木糖糖基化產(chǎn)物溶解度是RP的2.38倍,水熱糖基化反應(yīng)生成的RP-木糖糖基化產(chǎn)物相比于RP的溶解性質(zhì)得到部分改善。參與RP和木糖水熱糖基化反應(yīng)的主要氨基酸為精氨酸和賴氨酸,并且溶解度的改善與RP和木糖的共價(jià)結(jié)合密切相關(guān);且亞基結(jié)構(gòu)中谷蛋白聚肽、球蛋白亞基和谷蛋白堿性亞基可能參與到與木糖的糖基化反應(yīng)中,生成了RP-木糖高分子量聚集體;此外,二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)減少、無(wú)規(guī)則卷曲增加,這可能與熱引起的氫鍵的締合作用發(fā)生改變相關(guān)。由于改性后RP的溶解性仍然較低,且在糖基化過(guò)程中還有可能會(huì)產(chǎn)生糖基化的高級(jí)階段產(chǎn)物有害的AGEs,因此,需要對(duì)繼續(xù)采用合適的糖基化反應(yīng)來(lái)改善溶解性和其他功能性質(zhì),并對(duì)糖基化中可能產(chǎn)生的有害產(chǎn)物的控制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。