四株紅曲霉菌固態發酵木耳紅曲的性能比較

傅思瑞,劉 嵬,張彩梅,梁 立,甘 亞,顏 軍,何 鋼

(成都大學,四川抗菌素工業研究所,藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室,四川成都 610052)

紅曲霉菌是一種絲狀真菌,在發酵過程中可產生以洛伐他汀(Lovastatin)[1]、紅曲色素[2]為主的具有降血脂[3]、抗氧化功效[4]的次級代謝產物。已有研究表明紅曲霉菌發酵過程中產生糖化酶、蛋白酶等酶類,將原料中多糖、蛋白質等大分子物質降解成人體易于吸收的小分子片段,同時產生新的活性次級代謝產物[5]。黑木耳為木耳科木耳屬黑木耳的子實體,是一種珍貴的藥食兼用膠質真菌,研究表明黑木耳多糖具有降血脂、降血糖、抗氧化[6]及抗衰老等多種功效[7]。我國是黑木耳生產大國,但大多是粗加工,其有效成分沒有得到充分利用,應用深度和廣度不夠,因此黑木耳具有巨大的開發價值和良好前景。

微生物發酵或轉化是提高藥食同源真菌、植物資源功效成份高效利用的重要手段[8]。目前紅曲霉菌的生物轉化和固態發酵技術已有大量研究[9]和產品[10]開發上市,如:紅曲米、青稞紅曲茶、紅曲酒、紅曲面包等,但缺乏利用紅曲霉菌和木耳這類天然食用真菌的固態共發酵進行微生物轉化的報道,以木耳為發酵基質,用紅曲霉菌進行發酵生產具有降血脂和抗氧化的紅曲-木耳產品具有重要開發價值。由于部分紅曲霉菌代謝產生洛伐他汀及其同系列化合物的同時也會代謝產生高度致癌化合物桔霉素[11],限制了紅曲及紅曲霉菌發酵產品的開發和應用[12]。所以在紅曲霉菌發酵產品應用中需要對生產菌株進行篩選,得到低毒、高活性的生產菌株。故本實驗用四種不同的紅曲霉菌對木耳和大米進行了固態發酵,并對產品各項性能進行了分析比較,希望篩選出最適合固態發酵的產高色價、高含量洛伐他汀、低含量桔霉素的紅曲霉菌,結果可為后續生產木耳和紅曲發酵產品提供依據,為相關新型食品和藥品的研究與開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MonascuspurpureusWent.z 507(M.z507)、MonascuspurpureusWent.c 507(M.c507)、MonascuspurpureusWent.b 2019(M.b2019)、MonascuspurpureusWent.h 2019(M.h2019) 四株紅曲霉菌從不同廠家紅曲米中分離純化得到,經過分子鑒定為子囊菌綱曲霉科紅曲霉屬真菌紅曲霉菌,保藏于四川抗菌素工業研究所藥食同源開發重點實驗室;無水葡萄糖、濃硫酸、苯酚、3,5-二硝基水楊酸、NaOH、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、FeSO4、30%H2O2、水楊酸、磷酸、甲苯、乙酸乙酯、甲酸 均為分析純,成都市科龍化工試劑廠;無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇 均為分析純,成都市科隆化學品有限公司;BCA試劑盒 北京莊盟國際生物基因科技有限公司;DPPH標準品(>97%) 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;甲醇(色譜純) 西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;乙腈(色譜純) 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;洛伐他汀標準品(99.9%) 北京壇墨質檢科技有限公司;桔霉素標準品(98%) 北京百靈威科技有限公司。

HPLC A10型高效液相色譜儀 美國PerkinElmer Altus公司;UV-2600紫外可見分光光度計、LC-20A型高效液相色譜儀 島津儀器(蘇州)有限公司;TGL-16C型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;GL-21M型冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;FA2004B型電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司;DHP-9050B智能型電熱恒溫培養箱、LG-160S型全溫振蕩培養箱 上海瑯玕實驗設備有限公司;GR60DA型高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;HZQ-C/40-220r型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫療儀器廠;ZHJH-C1214B型超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;JY-1000A型高速多功能粉碎機 上海塞耐機械有限公司;ELX800型全自動酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;UPT-II-10T型超純水器 四川優普超純科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲霉菌孢子懸浮液制備 馬鈴薯葡萄糖液態培養基(PDA):40 g土豆加入200 mL純水煮沸30 min,過濾,取濾液,加入4 g無水葡萄糖,補水至200 mL。

挑取斜面培養基上紅曲霉菌菌絲,接種于含有200 mL液態培養基的500 mL錐形瓶中,置于恒溫振蕩培養箱中在轉速100 r/min,28 ℃下培養3～5 d至液體培養基變紅即可。

1.2.2 紅曲霉菌固態發酵木耳方法 紅曲霉菌固態發酵木耳的方法按照文獻方法稍做修改[13]。具體如下,大米浸泡1 h后蒸煮35 min,裝料量18 g/250 mL,大米∶木耳=4∶1,料液比(發酵原料∶水,g/mL)=1∶2,于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌20 min,滅菌完畢后取出放入超凈工作臺冷卻至室溫,接種紅曲霉菌(M.z507、M.z507、M.b2019、M.h2019)孢子懸浮液15 mL至固態發酵培養基中,每株紅曲霉菌做3個平行實驗,用接種鏟攪拌均勻,發酵溫度30 ℃,發酵時間14 d,每隔7 d補水一次,補水量為初加水量的5%。發酵結束后,發酵產物60 ℃烘干,粉碎,過40目篩備用。

1.2.3 發酵性能參數測定 發酵產物中粗多糖含量測定按照文獻[14]方法,稱取適量樣品進行熱水水浴提取,乙醇沉淀多糖,粗多糖復溶后采用硫酸-苯酚法測定含量。還原糖含量測定按照文獻[15]所述,取多糖提取液直接采用DNS試劑測定還原糖含量。蛋白質含量測定按照文獻[16] 方法,稱取適量樣品,用PBS緩沖液,超聲提取30 min,提取液采用BCA試劑法測定蛋白質含量[17]。對照組均為未發酵的固態培養基原料。

1.2.4 紅曲色素含量 紅曲色素包括水溶性和醇溶性色素兩類[18],以紅曲發酵樣品的色價替代紅曲色素含量。按照文獻方法[19]所述制備水溶性紅曲色素樣品,稱取1.0 g發酵樣品粉末3份,倒入150 mL錐形瓶,分別加入100 mL超純水,玻璃棒攪拌均勻,功率為280 W條件下超聲輔助提取30 min,提取液10000 r/min離心5 min,收集上清液待測。取上清液于試管中,加水稀釋,以蒸餾水為空白,于410和505 nm測定吸光度值。醇溶性紅曲色素樣品制備將提取溶劑換成75%乙醇溶液,其余步驟同上所述。以75%乙醇為空白,于410和505 nm測定吸光度值。水溶性和醇溶性紅曲色素均含有紅色素和黃色素,色價計算方法如下。

紅色素色價(U/mL)=OD505×稀釋倍數

黃色素色價(U/mL)=OD410×稀釋倍數

總色價(U/mL)=紅色價+黃色價

1.2.5 洛伐他汀含量測定

1.2.5.1 樣品前處理 稱取各樣品粉末1.2 g于50 mL容量瓶中,加入30 mL 75%乙醇,功率為280 W條件下超聲提取1 h后,用75%乙醇定容[20]。提取液8000 r/min離心10 min,過0.22 μm有機相微孔濾膜微濾,裝入進樣瓶,待測。

相當一部分基層民警對公安信息化也存在認識誤區。比較典型的錯誤認識包括:一是認為情報信息不是什么新事物，解放初期就有“警務跟著警情走”的說法，因此認為公安信息化建設只不過是“新瓶裝舊水”。二是認為信息化只是一場技術革新，公安信息化建設就是裝監控、建平臺，因此認為它是信通等技術部門的事，與我無關。三是認為信息化是形象工程，花那么多錢建平臺是擺那兒給各級領導參觀的，因此認為公安信息化建設中看不中用。這些認識誤區是基層民警對公安信息化建設提不起興致，消極被動應付的根本原因之一。

1.2.5.2 標準曲線制作及樣品中洛伐他汀含量測定 準確稱取0.0030 g洛伐他汀標準品于10 mL容量瓶中,用色譜純甲醇溶液溶解并定容至刻度線,配制成300 μg/mL洛伐他汀標準儲備液。移取適量洛伐他汀標準儲備液,配制成2、10、50、75、150、300 μg/mL的洛伐他汀標準工作液。以系列標準洛伐他汀濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標制得標準曲線。

色譜條件:高效液相色譜儀;安捷倫C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:室溫;流動相:V(甲醇)∶V(0.2%磷酸)=73∶27;流速:1 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長:238 nm。

1.2.6 桔霉素含量測定

1.2.6.1 樣品前處理 稱取2.0 g樣品粉末于5 mL磨砂玻璃試管中,加入2 mL萃取劑(甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=7∶3∶1,V/V,TEF)[21],渦旋30 s后,功率為280 W條件下超聲提取10 min,10000 r/min離心2 min,殘渣重復萃取1次,合并兩次上清液,過0.22 μm有機相微孔濾膜微濾,裝入進樣瓶,待測。

1.2.6.2 標準曲線制作及樣品中桔霉素含量測定 準確稱取0.0010 g桔霉素標準品于10 mL容量瓶中,用色譜純甲醇溶液溶解并定容至刻度線,配制成100 μg/mL桔霉素標準儲備液,4 ℃保存。并梯度稀釋成2、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.0125 μg/mL的桔霉素標準工作液。以系列標準桔霉素濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標制得標準曲線。

色譜條件:熒光高效液相色譜儀;InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A液為乙腈,B液為0.1%磷酸溶液;流速:0.7 mL/min;進樣量50 μL;檢測波長:激發波長350 nm,發射波長500 nm[22]。檢出限和定量限分別為25和80 μg/kg。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The conditions of gradient elution

1.2.7 紅曲色素抗氧化性

1.2.7.1 羥自由基的清除能力 按照文獻[23] 方法,配制1.8 mmol/mL FeSO4溶液、0.3% H2O2、1.8 mmol/mL水楊酸-乙醇溶液。將1.2.4中提取得水溶性和醇溶性色素樣品稀釋為0.01 g/mL,向試管中分別加入色素樣品各1.0 mL,FeSO4溶液2 mL,水楊酸-乙醇溶液1.5 mL,最后加入H2O20.1 mL啟動反應,振蕩均勻,水浴37 ℃保溫30 min。以1.0 mL超純水作為空白,操作同上。在波長510 nm處測定吸光度。

清除率(%)=[(A0-As)/A0]×100

式中:A0為空白管吸光度;As為樣品管吸光度。

1.2.7.2 DPPH·的清除能力 按照文獻[23]方法,移取水溶性和醇溶性色素樣品各0.1 mL,加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH(95%乙醇配制),振蕩均勻,避光37 ℃反應30 min。以0.1 mL超純水作為空白,操作同上。于517 nm處測定吸光度。

清除率(%)=(1-As/A0)×100

式中:A0為空白管吸光度;As為樣品管吸光度。

1.3 數據處理

數據處理采用Excel 2013軟件進行數據處理,所有實驗均重復操作3次,實驗結果均表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 發酵產物形態對比

M.z507紅曲霉菌株發酵產物顏色呈淡紅色,基質潮濕且略微松散,表面附著有一層橘紅色菌絲(圖1a);M.c507紅曲霉菌株發酵產物顏色紅色較淺,基質略微干燥且松散,表面菌絲生長旺盛(圖1b);M.b2019紅曲霉菌株發酵產物顏色呈鮮紅色,基質緊密潮濕,表面紅色菌絲生長旺盛(圖1c);M.h2019紅曲霉菌株發酵產物顏色呈深紫紅色,基質非常緊密潮濕,表面無明顯附著菌絲(圖1d)。通過比較原料發酵產物外觀形態來看,M.b2019和M.h2019這兩株紅曲霉菌株在含有木耳的基質原料中生長良好,代謝產生紅曲色素比另外兩株多,可能更適合用于固態發酵。

圖1 發酵產物形態對比Fig.1 Comparison of morphology of the fermentation products注:a:M.z507;b:M.c507;c:M.b2019;d:M.h2019。

2.2 發酵性能參數測定結果

4株紅曲霉菌固態發酵木耳和大米原料14 d后,按照1.2.3方法對發酵產品的性能參數進行測定,結果如表2所示。

表2 紅曲霉菌發酵木耳紅曲產品性能參數測定Table 2 The determination of performance parameters of Auricularia auricula Monascus products after fermentation by Monascus strains

由表2可得知,同原料對照組相比較,四株紅曲菌株發酵產物中粗多糖和蛋白質含量均比發酵前少,其中M.h2019菌株發酵組原料粗多糖消耗最多,僅剩原料的1/4,M.c507菌株發酵組原料粗多糖含量消耗量最少,僅為M.h2019消耗量的一半;M.z507組剩余蛋白質含量最少,減少至約對照組的1/3,M.h2019組剩余蛋白質含量最多,比對照組相比約消耗了一半。四組發酵產物中還原糖含量相對于發酵前都增加了,其中M.c507增加得最多,約為對照組的10倍,M.b2019和M.h2019較少,M.z507增加得最少。菌株生長過程中分泌糖苷酶和蛋白酶降解大米中淀粉、蛋白質等營養物質[24],同時代謝如果膠酶和糖苷酶,將木耳中大分子多糖化合物而轉化成了分子量較小的短鏈多糖、寡糖、還原糖等。M.c507菌株發酵組還原糖含量較高的原因可能是該菌株在大米-木耳混合基質上生長緩慢,消耗還原糖的量少,與之相反,其他3株菌在大米-木耳混合基質上生長良好。M.h2019組水溶性紅曲色素和醇溶性紅曲色素含量均是最高,其紅曲色素含量約為M.b2019組所產紅曲色素的5倍,其他兩株菌所產色素明顯較少,故M.h2019紅曲霉菌株適合用于高產紅曲色素的固態發酵。

2.3 洛伐他汀含量分析

由圖2可知,在2～300 μg/mL的范圍內,峰面積與洛伐他汀濃度線性關系良好,回歸方程為y=31067x-62851,R2=0.9986。

圖2 洛伐他汀標準曲線Fig.2 The standard curve of lovastatin

四種紅曲固態發酵產物中洛伐他汀含量見圖3和表3,標準品和發酵樣品中洛伐他汀均在25 min左右出峰,峰型良好,保留時間一致。樣品中,M.h2019菌株發酵所產洛伐他汀含量最高,為M.b2019菌株所產洛伐他汀的2.5倍,約為M.z507菌株所產洛伐他汀的17倍,M.c507菌株在發酵過程中幾乎不產洛伐他汀。這是由于洛伐他汀產量與紅曲色素產量呈正相關[25],四株紅曲菌株中M.h2019產紅曲色素最多,故其洛伐他汀產量最高,M.b2019和M.z507菌株產色素較少,則洛伐他汀產量相應較少,而M.c507菌株在發酵過程中只產生了極少量紅曲色素,所以幾乎不產洛伐他汀。因此,M.h2019最適合制備高產洛伐他汀的發酵產品。

圖3 洛伐他汀色譜圖Fig.3 The chromatogram of lovastatin

表3 四株紅曲霉菌產洛伐他汀和桔霉素的含量Table 3 The lovastatin and citrinin contents of four Monascus strains

2.4 桔霉素含量分析

圖4可知,在0.0125～2 μg/mL的范圍內,峰面積與桔霉素濃度線性關系良好,回歸方程為y=4160396x+16884,R2=0.999。

圖4 桔霉素標準曲線Fig.4 The standard curve of citrinin

四種紅曲固態發酵產物中桔霉素含量見圖5和表3,標準品和發酵樣品中桔霉素出峰時間均在9 min左右,保留基本時間一致,標準品峰型良好。樣品中,M.z507、M.c507、M.b2019均不產桔霉素,M.h2019菌株產桔霉素但含量低于國標限量(0.05 mg/kg)[26],所以該四株紅曲菌株發酵產品都具有安全性。

圖5 桔霉素色譜圖Fig.5 The chromatogram of citrinin

2.5 紅曲色素抗氧化性分析

2.5.1 羥自由基的清除能力 四株紅曲固態發酵產物中水溶性和醇溶性紅曲色素對羥自由基的清除能力見圖6。

圖6 四種紅曲色素羥自由基清除能力Fig.6 The hydroxyl radical scavenging ability of four Monascus pigments注:a:水溶性紅曲色素;b:醇溶性紅曲色素；圖7同。

由圖6a可知,水溶性紅曲色素的羥自由基清除能力由強到弱均依次為M.h2019、M.b2019、M.z507、M.c507,其清除率分別為76.19%、59.52%、45.24%、30.95%。M.h2019和M.b2019與M.c507存在顯著性差異,M.h2019清除率約為M.c507的2.5倍,M.b2019清除率約為M.c507的2倍,但M.b2019與M.h2019比較無顯著性差異;M.z507清除率與M.c507、M.h2019均具有顯著性差異。由圖6b可知,醇溶性紅曲色素的羥自由基清除能力由強到弱均依次為M.h2019、M.b2019、M.z507、M.c507,其清除率分別為83.33%、76.67%、35.00%、33.33%。M.h2019清除效果最好,約為M.c507的2.5倍,差異十分顯著;M.b2019清除能力顯著高于M.z507和M.c507。由此可知,除M.z507外,其余三組醇溶性紅曲色素的羥自由基清除能力均大于水溶性紅曲色素的羥自由基清除能力,M.h2019菌株無論是水溶性紅曲色素還是醇溶性紅曲色素對羥自由基的清除能力均為最強。

2.5.2 DPPH·的清除能力 四種紅曲固態發酵產物中水溶性和醇溶性紅曲色素對DPPH·的清除能力見圖7,這四株紅曲霉菌醇溶性紅曲色素均高于各自水溶性紅曲色素的清除能力。M.h2019菌株水溶性紅曲色素DPPH·清除率為19.90%,醇溶性紅曲色素DPPH·清除率為45.42%,其醇溶性的清除能力約為其水溶性的2倍,由圖7可知其水溶性和醇溶性紅曲色素DPPH·清除能力最強。M.c507、M.z507、M.b2019水溶性紅曲色素DPPH·清除率分別為11.75%、11.10%、10.45%,都約為M.h2019清除率的1/2。M.b2019、M.c507、M.z507醇溶性紅曲色素DPPH·清除率分別為16.34%、13.35%、11.12%,都約為M.h2019清除率的1/3。

圖7 四種紅曲色素DPPH·的清除能力Fig.7 The DPPH· scavenging ability of four Monascus pigments

綜上,表明紅曲色素具有抗氧化活性,四株紅曲霉菌株除M.z507外,所產的紅曲色素中醇溶性色素的抗氧化性均比水溶性色素的抗氧化性強。M.h2019菌株在木耳-大米復合基質上能夠較好生長,代謝產生大量紅曲色素。從洛伐他汀和桔霉素產生情況綜合分析表明,M.h2019適合木耳-大米復合基質固態發酵,生產抗氧化、降血脂的功能性食品。

3 結論

試驗結果表明利用紅曲霉菌對木耳進行微生物發酵之后,M.z507、M.b2019、M.h2019這三種紅曲霉菌株的固態發酵產物中洛伐他汀和紅曲色素等功效性成分和抗氧化性能力均有所提升。通過分析比較四株紅曲霉菌菌株對木耳-大米復合基質的發酵性能參數,功效成份含量,有害成份含量測定篩選出M.h2019可用于該復合基質的發酵生產。發現M.h2019菌株固態發酵產物中洛伐他汀含量最高,達到了1724.189 μg/g,且桔霉素含量低于國家標準限量,其他性能指標除多糖、還原糖和蛋白質之外均為最高值,可能是由于該種菌株在發酵過程中消耗了培養基中部分大分子糖類和蛋白質,轉化為了其他小分子代謝產物。所以選用M.h2019作為后續固態發酵制備高產色素和洛伐他汀的木耳紅曲產品的最佳菌種。