地膽草總黃酮的提取、純化及抑菌機(jī)理研究

雒江菡,崔琳琳,李 敏,劉 宇,吳雨璠,李小曼,張嘉寧,閻力君

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所,黑龍江哈爾濱 150076)

地膽草(Elephantopusscaber)為菊科,地膽草屬,直立草本,生于草地上,莖二歧分枝,有時全株有白色粗毛;基生葉叢生,葉片匙形或長圓狀倒披針形,邊緣稍有鈍鋸齒;莖生葉少,極小,全草入藥[1]。性味苦、涼,具有清熱解毒、利尿消腫等功效,主要用于感冒、急性扁桃體炎、咽喉炎、眼結(jié)膜炎、流行性乙型腦炎、百日咳、腫瘤等疾病治療和預(yù)防[2-3]。地膽草主要化學(xué)成分有黃酮類化合物、倍半萜內(nèi)酯、三萜、甾醇等[4-5],其中黃酮類化合物具有抗氧化和抑菌等作用。

目前采用有機(jī)溶劑提取、堿提等方法獲得的天然活性物質(zhì)提取液存在一定量雜質(zhì)[6-8]。大孔樹脂是一類不帶離子交換基團(tuán)的多孔型交聯(lián)聚合物,具有比表面積大、吸附容量大、選擇性好、前處理簡便、使用周期長、且不溶于酸堿及有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn),經(jīng)大孔樹脂處理后,可有效地去除粗提液中大量的糖類、蛋白質(zhì)等成分,使黃酮類化合物成分高度富集而提高其純度和品質(zhì),在分離純化黃酮類化合物的應(yīng)用中取得了很好的效果[9-10]。大多數(shù)黃酮類化合物均有較強(qiáng)的抗氧化作用,對多種微生物也具有較好的抗菌效果,可作為植物源抗菌劑加以應(yīng)用,目前對黃酮類化合物抗菌性能的研究較多[11-14],但對地膽草總黃酮抑菌機(jī)理研究較少,有待進(jìn)一步研究。

本實驗以地膽草(Elephantopusscaber)為材料,制備乙醇提取液,采用大孔樹脂對其純化,開展其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性及機(jī)理研究,為地膽草的制備提供科學(xué)方法,也為地膽草相關(guān)抗炎新藥及食品防腐劑的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地膽草藥材 購于北京同仁堂,哈爾濱商業(yè)大學(xué)中藥教研室鑒定為菊科植物白花地膽草干燥的葉片;大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25925)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923) 中國普通微生物菌種保藏管理中心;氨芐青霉素 優(yōu)級純,Sigma公司;95%乙醇、氯化鈉 國產(chǎn)分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉 生物化學(xué)試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;JSM-6510掃描電子顯微鏡 日本電子公司;PP-50-P11多功能電導(dǎo)率儀 德國賽多利斯。

1.2 實驗方法

1.2.1 地膽草總黃酮的提取及含量測定 精密稱取地膽草粉末(過20目篩)10 g,置冷凝回流裝置中,準(zhǔn)確加入80%乙醇100 mL,80 ℃加熱回流2 h,取出放冷,抽濾,將濾液濃縮、干燥,用去離子水定容至100 mL,備用[7]。

精確稱取10 mg蘆丁,用70%乙醇溶解并定容至50 mL即為標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80、1.00 mL,分別置于25 mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉0.3 mL,搖勻,放置6 min,加入10%硝酸鋁0.3 mL,混合均勻后放置6 min。加入1%氫氧化鈉溶液4 mL,用70%乙醇溶液稀釋至刻度,在紫外可見分光光度計的510 nm波長處,以0.00 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)零,檢測各組的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、以吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。經(jīng)計算得到回歸線方程y=10.308x-0.0015,R2=0.9993。

式(1)

式中:M為地膽草粗粉質(zhì)量(g);C為地膽草總黃酮溶液濃度(mg/mL);V為地膽草總黃酮溶液體積(mL)。

1.2.2 大孔樹脂動態(tài)純化實驗

1.2.2.1 D101大孔樹脂的預(yù)處理 適量蒸餾水將D101大孔吸附樹脂漂洗,再用80%乙醇浸泡24 h,然后用蒸餾水將樹脂沖洗至無醇味,用2倍于樹脂體積的5%鹽酸浸泡2 h,用蒸餾水沖洗至中性;再用2倍樹脂體積的5%氫氧化鈉浸泡2 h后用水洗至中性,備用。

1.2.2.2 地膽草總黃酮的純化 取上述預(yù)處理好的D101大孔樹脂用80%乙醇濕法裝柱,上樣液濃度為(3.44±0.02) mg/mL,用濃度80%乙醇作為洗脫劑,3 BV/h的流速進(jìn)行洗脫,按20 mL收集液作為1個流分,等體積收集20瓶,以收集的流分序號為橫坐標(biāo),以地膽草總黃酮的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),并繪制洗脫曲線[16]。

1.2.3 地膽草總黃酮抑菌試驗

1.2.3.1 抑菌圈大小測定 將15 mL 50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒于無菌培養(yǎng)皿中,待凝固后,將0.1 mL濃度為1×105CFU/mL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液,用涂布棒均勻涂于培養(yǎng)基表面。用無菌鑷子將直徑為6 mm的滅菌干燥濾紙片,分別放入裝有純化后的地膽草提取液、無菌水(陰性對照)和氨芐青霉素(陽性藥)的培養(yǎng)皿中浸泡30 min,然后取出濾紙片,在培養(yǎng)皿內(nèi)壁上濾去多余藥液,將濾紙片貼于上述平板表面,貼好濾紙片的平板在室溫下放置20 min后于37 ℃培養(yǎng)24 h,取出測定抑菌圈直徑大小,比較抑菌效果[17-18]。

1.2.3.2 MIC實驗 最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentrations,MIC)用來檢測抑制細(xì)菌明顯生長和繁殖的最小藥物濃度。用移液槍將100 μL培養(yǎng)基加入到96孔板中,再加入100 μL地膽草,用二倍稀釋法得到地膽草的濃度分別為4.899、2.450、1.225、0.612、0.306、0.153 μg/mL,分別加入大腸桿菌、金黃色葡萄球菌10 μL。空白對照區(qū)只加培養(yǎng)基,陽性對照區(qū)只含有大腸桿菌和培養(yǎng)基,陰性對照區(qū)含有不同濃度的地膽草總黃酮、大腸桿菌和培養(yǎng)基,將加好樣品的微量MIC測定板放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,用酶聯(lián)儀測定OD600并換算透光率,以透光率為評價指標(biāo),若透光率小于50%,則視為有菌生長,透光率大于50%所對應(yīng)的藥液濃度即為MIC[19],金黃色葡萄球菌MIC測定方法同上述大腸桿菌。

透光率(%)=(扣除培養(yǎng)基基本底的陽性對照吸光值-扣除地膽草析出本底的驗孔吸光度值)/扣除培養(yǎng)基本底的陽性對照吸光度值×100

其中:扣除培養(yǎng)基本底的陽性對照吸光值=陽性對照區(qū)的吸光值-空白對照區(qū)吸光值

扣除地膽草析出本底的試驗孔吸光值=試驗區(qū)的吸光值-相應(yīng)陰性對照區(qū)的吸光值

1.2.3.3 電導(dǎo)率實驗 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于250 mL液體培養(yǎng)基中,向培養(yǎng)基中加入濃度分別為3、2、1 MIC的地膽草總黃酮溶液,空白對照組為不含藥液的菌液。兩種菌各配制12組,每組平行做3次,在相同時間下置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、10、18、24 h時,依次取出一瓶,以4000 r/min離心30 min,取上清液用蒸餾水稀釋至40 mL,用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率值。

1.2.3.4 掃描電鏡觀察 將3倍MIC地膽草總黃酮提取液加入到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液中,以蒸餾水代替地膽草總黃酮溶液作為對照組,37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后,3000 r/min離心30 min,去上清,加入500 μL 0.2 mol/L(pH=7)磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗2次;在沉淀中加入4%戊二醛1 mL充分混勻,4 ℃靜置24 h;3000 r/min離心15 min,去上清;加入500 μL PBS洗2次(用PBS溶解菌體,用槍輕輕吹打,離心棄去PBS,再加入新鮮的PBS,混勻離心)。用30%、50%、70%、90%和100%不同濃度乙醇脫水,每次脫水10 min,然后3000 r/min離心15 min,用100%叔丁醇置換100%乙醇2～3次,乙醇菌液離心后,去上清,加200 μL 100%叔丁醇4 ℃放置30 min。冷凍干燥過夜,再將樣品黏于樣品臺,用離子濺射儀給樣品10 nm金膜,噴金150 s,然后用掃描電子顯微鏡觀察[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復(fù)三次,實驗數(shù)據(jù)采用實驗結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,運(yùn)用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 地膽草總黃酮的提取結(jié)果

按照方法1.2.1進(jìn)行地膽草總黃酮提取及含量測定,得到粗提液94 mL,經(jīng)濃縮、干燥后,用去離子水溶解并定容至100 mL后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行地膽草總黃酮含量測定,此時地膽草總黃酮濃度為(0.175±0.004) mg/mL,地膽草總黃酮的含量為(1.75±0.04) mg/g,說明醇提法適合地膽草總黃酮的提取。

2.2 地膽草總黃酮的純化結(jié)果

大孔吸附樹脂的吸附實質(zhì)為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象,這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果;同時由于大孔吸附樹脂的多孔性結(jié)構(gòu)使其對分子大小不同的物質(zhì)具有選擇性地吸附[21]。地膽草總黃酮與提取液中的多糖等雜質(zhì)根據(jù)吸附力及分子量的大小不同,在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫速度不同而達(dá)到純化的目的。由圖1可以看出,第9瓶地膽草總黃酮濃度最高,總黃酮溶液的溶解性較好,溶液呈棕黃色、澄清透亮,此時地膽草總黃酮濃度為0.27 mg/mL。

圖1 大孔樹脂洗脫曲線Fig.1 Desorption curves of macroporous resins for flavonoids

2.3 地膽草總黃酮抑菌試驗結(jié)果

2.3.1 抑菌圈大小比較 由表1可以看出,地膽草總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用,抑菌圈直徑分別為(1.80±0.03) cm和(1.60±0.02) cm,對大腸桿菌抑菌效果稍好,可以進(jìn)一步通過最小抑菌濃度(MIC)實驗進(jìn)行評價。

表1 地膽草總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果的比較Table 1 The antibacterial effect comparison of total flavonoids from Elephantopus scaber against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.3.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定結(jié)果 用酶聯(lián)儀測定OD600并換算透光率,結(jié)果如表2。若試驗孔的透光率均<50%視為有菌生長,因此,無菌生長的地膽草總黃酮最低濃度,即為該地膽草總黃酮MIC值。從表2中可以得出,當(dāng)?shù)啬懖菘傸S酮濃度在0.612 μg/mL時,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌平均透光率高于50%,低于該質(zhì)量濃度由于透光率較低,故認(rèn)為無法抑菌,因此,地膽草總黃酮最小抑菌濃度(MIC)是0.612 μg/mL。

表2 不同濃度地膽草總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌透光率的影響Table 2 The luminousness effect of different contrations of total flavonoids from Elephantopus scaber on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.3.3 電導(dǎo)率大小的比較 電導(dǎo)率是表征溶液中離子濃度高低的一個重要參數(shù),電導(dǎo)率的高低與離子濃度有著十分密切的聯(lián)系[22-23]。從圖2中可以看出,三個不同水平加藥組的大腸桿菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率隨培養(yǎng)時間延長,先上升后下降,而金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液是呈現(xiàn)先下降后上升,然后再下降的變化趨勢。這說明地膽草總黃酮對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均具有抑制作用,且地膽草總黃酮的濃度越大,抑菌效果越好。將地膽草總黃酮加入大腸桿菌菌液培養(yǎng)0.5 h后,電導(dǎo)率逐漸升高,這主要是因為大腸桿菌是革蘭氏陰性菌,細(xì)胞壁肽聚糖層交聯(lián)度較低,細(xì)菌內(nèi)部受到地膽草總黃酮的作用后,菌體的細(xì)胞膜通透性改變,內(nèi)有細(xì)胞內(nèi)容物流出,改變了培養(yǎng)基的電導(dǎo)率,電導(dǎo)率呈增大的趨勢[24]。在培養(yǎng)一段時間后,電導(dǎo)率略有下降,可能有一部分存活的大腸桿菌,隨著培養(yǎng)延長,菌體生長消耗了培養(yǎng)液中的無機(jī)鹽類,導(dǎo)致電導(dǎo)率降低,但由于給藥濃度不同,對大腸桿菌的生長抑制能力不同;而金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌,肽聚糖成分較高,細(xì)胞壁交聯(lián)度高,在剛加入地膽草總黃酮后,金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁并未瞬間發(fā)生變化,隨著加藥后培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,細(xì)胞膜透性改變,細(xì)胞內(nèi)容物釋放,電導(dǎo)率上升,由于給藥濃度的不同,在培養(yǎng)一段時間后,電導(dǎo)率又不同程度的呈現(xiàn)下降趨勢,這是由于沒有死掉的金黃色葡萄球菌生長繁殖消耗電解質(zhì)導(dǎo)致的培養(yǎng)液電導(dǎo)率下降[25-26]。

圖2 地膽草總黃酮對大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響Fig.2 The electrical conductivity effect of total flavonoids from Elephantopus scaber on Escherichia coli(A)and Staphylococcus aureus(B)culture solution注:A為大腸桿菌;B為金黃色葡萄球菌。

2.3.4 掃描電鏡觀察結(jié)果 由圖3可以看出,地膽草總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生影響。正常的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞形態(tài)完整、飽滿,分別呈短桿狀和球狀,分布均勻且光滑。采用掃描電鏡對處理后的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌表面觀察發(fā)現(xiàn),兩種微生物表面變得粗糙,有的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,這主要是由于地膽草總黃酮對微生物的細(xì)胞壁破壞,粗糙部位的細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變,導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變[27-28],進(jìn)一步證實地膽草總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性。

圖3 掃描電鏡觀察大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)(4000×)Fig.3 The morphology of Escherichia coli and Staphylococcus aureus observed under scanning electron(4000×)注:Ⅰ:正常大腸桿菌;Ⅱ:正常金黃的葡萄球菌;Ⅲ:處理后大腸桿菌;Ⅳ:處理后金黃色葡萄球菌。

3 結(jié)論

通過對地膽草總黃酮進(jìn)行了提取、抑菌活性比較及抑菌機(jī)理的研究,結(jié)果顯示,乙醇可以作為溶劑進(jìn)行地膽草總黃酮的提取;利用大孔樹脂對地膽草總黃酮提取液進(jìn)行純化,純化后的溶液呈棕黃色、澄清透亮,證實大孔樹脂對地膽草總黃酮有一定的純化效果;通過抑菌圈和最小抑菌濃度的測定,證實地膽草總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用;電導(dǎo)率和掃描電鏡實驗觀察處理后的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌發(fā)現(xiàn),細(xì)菌細(xì)胞表面變得粗糙,同時,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。因此,進(jìn)一步證實了地膽草總黃酮有一定的殺菌作用,為地膽草在中藥抗炎藥物及食品抗菌劑等方面的進(jìn)一步開發(fā)提供了一定理論依據(jù)。