紅曲菌Mn-SOD基因克隆、表達及序列分析

何雨峰,韋 勝,岳碩豪,2,徐 澤,秦 松,黃瑩琪,鄧 穎,王偉平,*

(1.湖北工業大學生物工程與食品學院發酵工程教育部重點實驗室,湖北武漢 430068;2.武漢生物工程學院應用生物技術研究中心,湖北武漢 430415)

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一種十分重要的生物體防御氧化損傷的抗氧化酶[1],它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫,在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用,與很多疾病的發生、發展密不可分,其制品在醫藥、食品、化妝品等領域具有廣泛應用前景,因此對微生物SOD的研究又具有特殊的意義和實際應用價值[2]。SOD根據其酶活性中心輔基結合的金屬離子不同,分為銅鋅超氧化物歧化酶(Copper and Zinc Superoxide Dismutase,CuZn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase,Mn-SOD)和鐵超氧化物歧化酶(Iron Superoxide Dismutase,Fe-SOD)[3-4]。Mn-SOD的活性與表達量的變化可引起某些腫瘤性疾病,機制主要與其抗氧化作用減弱有關[4-5]。例如,Mn-SOD在螺旋神經節頂、底部區域的差異表達,可能為噪聲性聾高頻聽力易損性的分子機制之一[6]。通過序列分析了解Mn-SOD基因的類型及功能意義重大。

目前為止,國內外學者已從油茶、擬南芥、茄子、大豆、小麥、對蝦和小鼠等多種動植物[7-15]以及微生物[16-22]中克隆了Mn-SOD基因,并分別在畢赤酵母、大腸桿菌或乳酸乳球菌等目標菌體中進行了表達。基因工程法是獲得應用所需要Mn-SOD產品的有效途徑[23]。

紅曲菌(Monascus)是一種少有的嗜酸性絲狀腐生真菌,其中部分代謝產物具有降血壓、降血脂、抗菌、抗氧化和抗癌等重要的生理活性[24-25]。這些活性與Mn-SOD的功能有著密切的關系。本研究通過設計紅曲霉Mn-SOD基因引物,利用PCR技術擴增MonascusH4000 Mn-SOD基因的全長序列,經EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后,連接至相同酶切的表達載體pET28a,并轉化至E.coliBL21進行誘導表達,通過SDS-PAGE檢測蛋白表達情況,并對表達蛋白進行酶活檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、primer premier 5.0、SnapGene Viewer；紅曲菌H4000、大腸桿菌DH5α、質粒pET39b、pET28a 均由本實驗室保存；基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒 Omega Bio-Tek公司;限制性核酸內切酶、T4連接酶、Taq酶 寶生物工程(大連)有限公司。

Mycycle型PCR儀、Gel Doc XR+型凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司;DYCP-31DN型水平電泳槽、DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠;WFJ2000型分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 簡并引物的設計和篩選 a.查找Mn-SOD序列。從數據庫NCBI中搜索SOD基因的氨基酸序列,選取了曲霉屬(Aspergillus)中具有代表性的如下6個的序列:紅曲霉Aspergillusniger(GenBank登錄號:ABA71743.1)、煙曲霉Aspergillusfumigatus(GenBank登錄號:EAL90786.1)、米曲霉Aspergillusoryzae(GenBank登錄號:AAU04411.1)、白曲霉Aspergilluscandidus(GenBank登錄號:AAU04409.1)、黑曲霉Aspergillusphoenicis(GenBank登錄號:AAU04413.1)和黃曲霉Aspergillusflavus(GenBank登錄號:AAU04410.1)。

b.Block比對。參照文獻[26]的方法進行Block比對。登錄Blockmaker,對上述6個序列進行Block比對,得到3個高度保守的連續氨基酸區域。Block比對后,從Block results界面登錄CODEHOP數據庫進行引物搜索。搜索主要參數設定為:簡并度64,退火溫度為60 ℃,遺傳密碼為standard,密碼子選用框的備選項沒有目標物種,則選用與目標物種親緣關系較近的物種構巢曲霉(Aspergillusnidulans)。

c.利用primer premier 5.0進行引物分析。引物不能含有牢固的自身互補序列;避免上下游引物之間互補形成引物二聚體;避免4個以上的連續單一堿基和同源堿基。上游簡并引物(Forward)前端加上EcoR Ⅰ 酶切位點、下游簡并引物(Reverse)前端加上NcoⅠ酶切位點。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成相應的引物。

1.2.2 Mn-SOD基因部分序列的克隆 將本實驗室保存的紅色紅曲霉活化后接到馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA培養基)斜面,30 ℃培養7 d。待菌體成熟后加入10 mL無菌水,用接種環刮下菌體,轉接到搖瓶中,于30 ℃搖瓶發酵6 d。收集菌絲,取菌體進行液氮研磨,用試劑盒提取基因組。

設置程序進行梯度PCR,設置PCR儀程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,65 ℃(62.6、55.9、53.2、51.7、50 ℃)30 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min,24 ℃ 1 min。30個循環。PCR體系:UP water 133.5 μL,10×buffer 18 μL,dNTP(10 μmol/L)3.6 μL,上游引物F 7.2 μL,下游引物R 7.2 μL,Taq酶 4.5 μL,模板(63.6 ng/μL)6 μL。混勻后分裝至PCR管。

將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,并切膠回收目的基因。取pET39b 30 μL及回收目的基因片段30 μL,分別加入NcoⅠ 1.5 μL,K buffer 4 μL,BSA 4 μL,混勻后37 ℃過夜酶切,再分別加入EcoR Ⅰ 1.5 μL,37 ℃酶切2 h,進行瓊脂糖凝膠電泳,試劑盒回收目的載體和SOD片段。取SOD基因 2 μL,pET39b 1 μL,T4連接酶 3 μL,混勻后在16 ℃用T4連接酶連接2 h,并連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中。挑單克隆進行菌液PCR。PCR體系:UP water 165 μL,10×buffer 22 μL,dNTP(10 μmol/L)4.4 μL,上游引物F 8.8 μL,下游引物R 8.8 μL,Taq酶 5.5 μL。PCR設置程序如下:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min,24 ℃ 1 min,35個循環。PCR產物分別取3 μL進行凝膠電泳,并取菌液5 μL于3 mL B(A+)中,過夜搖菌,提質粒。送到鉑尚生物技術(上海)有限公司武漢測序部測序。

1.2.3 紅曲霉Mn-SOD全長基因的引物設計及Mn-SOD全長基因PCR擴增 根據測序所得的紅曲菌H4000 Mn-SOD基因序列,設計全長擴增引物,并添加酶切位點,上下游引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

以紅曲霉基因組為模板,設計全長引物PCR擴增Mn-SOD基因。向500 μL離心管中加入UP water 133.5 μL、10×buffer 18 μL、dNTP 3.6 μL、F 7.2 μL、R 7.2 μL、Taq酶6 μL、模板6 μL。PCR程序如下:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min,15 ℃ 10 min,35個循環。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用試劑盒回收目的基因條帶。EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切目的基因和質粒pET28a,T4連接酶連接,再轉化DH5α感受態細胞中,在含有卡那霉素(100 mg/L)的LB抗性培養基中培養,篩選挑陽性克隆,進行菌落PCR,PCR體系為UP water 16 μL、10×buffer 2 μL、dNTP 0.5 μL、T7-F 0.5 μL、T7-R 0.5 μL、Taq酶 0.5 μL;PCR程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,72 ℃ 10 min,5 ℃ 10 min;30個循環。并分別用試劑盒提取質粒,將質粒送到鉑尚生物技術(上海)有限公司武漢測序部進行測序。

1.2.4 重組表達載體的構建篩選及誘導表達 將重組質粒轉入感受態E.coliBL21中,在LB抗性(含50 mg/L的Kanamycin)平板上37 ℃培養16 h。挑取陽性單菌落至5 mL的LB液體培養基中,在37 ℃、200 r/min條件 下培養16 h。以1%的接種量轉至100 mL的含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基,在37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養約2.5 h。以3 mL純培養基為對照,從培養物中無菌取樣3 mL菌液測定600 nm處的吸光度。當OD600達到0.4時,向培養基中加入1 mol/L的50 μL的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導,其中1瓶不加入誘導作為對照。調節培養溫度至18 ℃,200 r/min振蕩繼續培養約18 h。

1.2.5 重組表達蛋白的SDS-PAGE電泳 將誘導后的菌液,以4000 r/min離心5 min,收集菌體沉淀,溶于10 mL PBS溶液。于φ6、1 s/3 s、20%功率分別超聲波破碎誘導前后的菌液10 min,以4000 r/min離心收集誘導前及誘導后上清。用磁珠吸附上清,分別用不同濃度的Wash Buffer進行清洗,收集清洗液樣品。分別取30 μL樣品,向其中各加入10 μL 4×SDS-PAGE上樣緩沖液,100 ℃熱處理10 min后,取10 μL進行SDS-PAGE電泳分析,濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度14%。

1.2.6 重組蛋白的酶活性質 誘導后菌液600 μL于EP管。將EP管置于離心機13000×g離心5 min,棄上清;分別加入200 μL PBS緩沖液,渦旋混勻,用超聲波破胞1 min(φ6、1 s/3 s、20%功率),在4 ℃下16000 g離心10 min,取破胞上清酶液分別于9 mL的不同pH的PBS溶液中,在25 ℃水浴保溫1 h后,用鄰苯三酚自氧化法[27-28]測定表達蛋白Mn-SOD在不同pH條件下的耐酸性。

自氧化的測定:在25 ℃條件下,向4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)中加入10 μL 50 mmol/L的鄰苯三酚,并迅速搖勻,倒入比色皿,在325 nm波長下每隔30s測一次吸光度值,共測6次,自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。酶活檢測:分別在pH2.0、pH4.0、pH7.0的條件下保溫處理1 h后,向25 ℃的4.5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)中加入100 μL待測酶液,再加入10 μL 50 mmol/L的鄰苯三酚,迅速搖勻,倒入比色皿。在325 nm 波長下每隔30 s測一次A值,共測6次。每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化率50%的酶量定為1個活力單位。SOD單位活力(U/mL)=(A0-AS)/(AS×50%)×4.5/V×N式中:A0為自氧化速率;AS為加入樣液后的氧化速率;V為加樣體積;N為樣品稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 簡并引物設計及PCR結果

根據數據庫比對結果,最終選取一對簡并引物用于本實驗。上游簡并引物(Forward)、下游簡并引物(Reverse)的序列見表1。

表1 簡并引物序列表Table 1 Degenerate primer sequence

對PCR產物進行凝膠電泳,如圖1所示,大小約320 bp。

圖1 簡并引物PCR擴增基因片段Fig.1 Gene fragments amplified from Monascus ruber by PCR with degenerate oligonucleoide primers注:M:200Marker;1:PCR產物。

雙酶切后,將目的片段與pET39b載體連接后導入大腸桿菌進行培養,菌液PCR鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示,從3、8號泳道可以看出,條帶大小約1200 bp。將3號和8號送到鉑尚生物技術(上海)有限公司武漢測序部進行測序。

圖2 pET39b載體連接產物菌液PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 PCR identification electrophorogram of PET396 ligation products注:M:DNA Marker,1-10:挑取10個菌落PCR結果。

2.2 全長引物設計及全長基因分析

根據比對結果,對比橙色紅曲霉以及其他物種序列,設計全長引物如表2所示。

表2 全長基因引物序列Table 2 Full-length gene primer sequence

連接產物轉化后培養,進行菌落PCR鑒定,1、3、9、10號泳道有較為清晰條帶,約1000 bp(圖3)。挑單克隆提質粒,凝膠電泳鑒定,如圖4所示,2號泳道約600 bp的目的基因條帶,證明為正確的轉化子。

圖3 菌落PCR鑒定電泳圖Fig.3 PCR identification electrophorogram of colony注:M:DNA Marker,1～10:挑選的10個菌落PCR結果。

圖4 重組載體質粒電泳鑒定Fig.4 Identification of recombinant vector plasmid注:M:2000marker,1、2:質粒酶切。

將全長引物PCR后所得目的基因序列進行測序,并進行分析。NCBI結果顯示,該序列與橙色紅曲霉的超氧化物歧化酶(SOD)基因相似度較高,達到99%。用SnapGene Viewer打開分析序列,翻譯出對應的氨基酸序列,并將氨基酸序列輸入到ExPASy進行一級結構分析,分析結果(圖5、圖6)顯示:氨基酸總數為152個,分子量為17057.27,其中負電荷氨基酸殘基14個,正電荷氨基酸殘基13個。

圖5 紅色紅曲霉(紅色紅曲霉CCTCC NO. M2013082)Mn-SOD基因序列Fig.5 Monascus ruber(Monascus rubber CCTCC No. M2013082)sequence of Mn-SOD gene

圖6 紅色紅曲霉(紅色紅曲霉CCTCC NO. M2013082)Mn-SOD氨基酸序列分析Fig.6 The Mn-SOD amino acid sequence analysis in Monascus ruber(Monascus rubber CCTCC No.M2013082)

2.3 表達載體的構建及重組蛋白的原核表達

將重組質粒轉入感受態的E.coliBL21中,于含卡那霉素的LB培養基培養,挑選陽性克隆進行擴大培養,當培養OD600達到0.4時,加入IPTG誘導約18 h,分別收集IPTG誘導前及誘導后E.coliBL21破胞上清進行SDS-PAGE蛋白電泳。如圖7所示,在采用不同濃度咪唑洗脫之后,與對照比較,在500 mmol/L濃度咪唑出現單一條帶,分子量約為19 kDa。對比徐龍等[9]以茄子葉片cDNA為模板擴增產物Mn-SOD基因,轉化進大腸桿菌中表達出分子量約25.63 kDa的重組蛋白;王黎明等[18]以蠟樣芽孢桿菌M22的Mn-SOD基因構建了畢赤酵母表達質粒通過電激法導入畢赤酵母其表達蛋白的相對分子量約為23 kDa。本研究目標蛋白的預估分子量也為17 kDa左右,表明成功表達了Mn-SOD蛋白。

圖7 表達產物的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE profile of expressed products注:150前-未誘導細胞破胞上清液以150 mmol/L Wash Buffer清洗所得上清液；150后-誘導細胞破胞上清液以150 mmol/L Wash Buffer清洗所得上清液；500前-未誘導細胞破胞上清液以500 mmol/L Wash Buffer清洗所得上清液；500后-誘導細胞破胞上清液以500 mmol/L Wash Buffer清洗所得上清液。

2.4 表達蛋白的酶活測定

取1 mL誘導后破胞上清酶液分別于9 mL的不同pH的PBS溶液中,在25 ℃水浴保溫1 h,用鄰苯三酚自氧化法測定Mn-SOD活性。計算pH2.0、4.0、7.0條件下Mn-SOD酶活的相對酶活性(圖8)。該Mn-SOD pH4.0條件下保溫處理1 h后,酶活為230 U/mg,在pH7.0條件下保溫處理1 h后,酶活為125 U/mg;在pH2.0條件下保溫處理1 h,酶活為159 U/mg。可以看出該蛋白在pH2.0～7.0均具有活性,pH2.0保溫處理1 h仍具有較高的Mn-SOD酶活。

圖8 不同pH環境下表達蛋白Mn-SOD的活性Fig.8 The activity of the expression of Mn-SOD in different pH environment

3 結論與討論

有報道稱,紅曲霉中Mn-SOD序列可能與桔霉素的產生密切相關,涂追[20]在橙色紅曲菌中克隆得到了八條可能與桔霉素產毒相關的EST序列,經生物信息學分析,發現其中一個基因P5編碼的蛋白與Mn-SOD高度同源,因此得到紅曲霉Mn-SOD序列對研究紅曲霉低產桔霉素的調控具有重要影響。

本研究通過設計紅曲霉Mn-SOD基因引物,利用PCR技術擴增MonascusH4000 Mn-SOD基因的全長序列,經EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后,連接至相同酶切的表達載體pET28a,并轉化至E. coli BL21進行誘導表達,通過SDS-PAGE檢測蛋白表達情況,與預測相對分子量基本相符,并對表達蛋白檢測酶活,發現在pH2.0條件下仍具有較高活性,表明該酶具有良好的耐酸性。本研究將紅曲霉Mn-SOD歧化酶基因導入到原核生物中實現表達,為紅曲霉Mn-SOD歧化酶的大規模生產、分離提供了可能。此外,利用基因工程技術生產Mn-SOD,能夠解決工業上從動植物中直接分離提取SOD的原料限制問題,應用前景廣闊。總之,本研究對紅曲菌Mn-SOD活性與功能的研究具有重大的研究意義,并且對紅曲食品工業化生產具有巨大價值。