菌絲霉素在酪丁酸梭菌中的表達研究

賈軍皓,曹 丁,陳勉華,趙培靜,明飛平,梁倩怡,李嘉怡,樊 欽,鄧錦波,張淑霞,馬苗鵬,張玲華,*

(1.華南農業大學生命科學學院,廣東省農業生物蛋白質功能與調控重點實驗室,廣東廣州 510642;2.廣州工業微生物檢測中心,廣東廣州 510663)

在肉類食品的養殖中抗生素作為非營養性促生長劑被廣泛應用,長期的使用和濫用造成了嚴重的后果,如廣譜及交叉耐藥性,導致肉類食品中抗生素殘留以及肉食類畜禽免疫機能的嚴重下降等[1]。另外,在食品加工和生產過程中為了延長食品的貨架期,通常添加防腐劑抑制微生物。然而現在市場上主要以化學防腐劑為主,具有不環保,毒性大等缺點[2]。這些問題日趨嚴重,嚴重威脅著食品安全和人類健康。尤其是近年來“超級細菌”逐漸增多,加之農業部發布了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃2017-2020》,2020年全面禁止在正常養殖過程中使用抗生素[3]?！妒称饭I“十三五”發展規劃》中明確提出:加快發展功能性食品添加劑,鼓勵和支持天然防腐劑;重點利用生物工程技術和生物發酵制品的技術提高提取物質量[4]。因此,尋找和生產這種高效和安全的天然抑菌劑迫在眉睫。

抗菌肽是廣泛存在于生物體內的一類內源性小分子肽類物質,是動物機體內天然免疫的重要成分,抗菌肽種類繁多,抗菌譜廣,殺傷力強,對某些耐藥性病原菌也有很強的滅菌作用,是抗生素的最佳替代品之一[5]。菌絲霉素(Plectasin)是一種真菌抗菌肽,對革蘭氏陽性致病菌有很好的殺傷性,且能在重組菌中高效表達[6]。目前菌絲霉素主要通過以下3種途徑獲得:直接從生物體內分離純化;人工化學合成;基因工程進行重組菌的表達。其中,直接提取難度較大,化學合成成本太高,規模化生產難度較大[6]。在現有的重組菌中的表達產量較低,且不是自誘導表達型[7]。將菌絲霉素的來源拓展到具有廣闊開發前景的酪丁酸梭菌中,加上強啟動子后從中高水平表達提取菌絲霉素獲得成功,將大幅降低菌絲霉素等抗菌肽的研發和生產成本,從而加速這類新型抗菌生物制品的開發和在食品加工和生產中推廣應用[8],具有重要意義。

酪丁酸梭菌,又名丁酸梭菌,是一種專性厭氧、革蘭氏陽性的梭狀芽孢桿菌,主要存在于動物糞便、土壤環境中。最早于1933年由日本千葉醫科大學宮入近治博士首先發現并報抑制作用。謝樹貴等[9-10]的研究發現,酪丁酸梭菌對腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的具有明顯的拮抗作用。在共同培養的整個過程中,對金黃色葡萄球菌的抑制作用十分強烈[9]。另外,研究表明,酪丁酸梭菌能使上調IL-18的基因表達并促使產生IL-18蛋白[11]。這種促進IL-18的基因表達作用無論在小鼠體內實驗或體外上皮細胞實驗中都得到證實[12],且有良好的發酵基礎和生產技術,是表達和分泌外源蛋白的重要模式菌株。使用強并可控的啟動子是高效表達的關鍵因素之一。加上強啟動子的重組菌可以超高水平表達菌絲霉素蛋白,其表達量遠遠超過其他重組菌,并且還能夠直接用于制備安全的具有抑菌功能的益生菌制劑,對金黃色葡萄球菌,化膿鏈球菌,無乳鏈球菌,糞腸球菌等抑菌作用明顯[13]。本研究獲得了高效表達菌絲霉素的酪丁酸梭菌重組菌。因為酪丁酸梭菌是嚴格的益生菌厭氧菌,且含有芽孢[14],作為抑菌食品添加劑,不僅防止食物腐爛,對食用者腸道免疫功能也很有益[15]。所得的菌劑可替代部分抗生素,為綠色,安全食品生產,提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

載體pMTL82151 由華南理工大學生命科學學院王菊芳教授團隊惠贈;酪丁酸梭菌(ClostridiumtyrobutyricumATCC 25755) 購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心;受試菌 金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923),由本實驗室保存;菌絲霉素標準品 購自廣州德為生物科技有限公司;LB液體培養基 10 g/L蛋白胨,5 g/L酵母提取物,10 g/L氯化鈉,pH7.0;LB固體培養基 對應液體培養基中加入1.2% 瓊脂粉;RCM液體培養基 梭菌增殖培養基38 g/L,溶于雙蒸水中,pH7.0;RCM固體培養基 對應液體培養基中加入1.2%瓊脂粉;液體和固體培養基 均在121 ℃,20 min條件下高溫濕熱滅菌。

電泳系統 XCell SureLock? Mini-Cell蛋白垂直電泳槽(北京瑞茂宏達科技有限公司美國生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設計 本研究中使用的引物均由Primer5.0設計,并由廣州擎科生物有限公司合成。名稱與序列如表1所示:

表1 本研究使用的引物 Table 1 Primers used in this study

1.2.2 質粒構建方案 本實驗中所使用的表達用質粒載體為pMTL82151,首先將Pthl克隆到載體pMTL82151上,得到質粒pMTL82151-thl,然后再將產菌絲霉素基因Pt克隆到Pthl的下游,得到Pt基因表達質粒pMTL82151-Pt,如圖1所示。

圖1 質粒構建示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasmid construction

1.2.3 質粒pMTL82151-thl的構建 先使用thl-XbaI-F/R擴增,然后以其擴增產物為模板,利用thl-F/R繼續擴增,得到thl基因的擴增產物。PCR程序:98 ℃預變性2 min,變性(98 ℃,10 s)、退火(55 ℃,30 s)、延伸(68 ℃,20 s)三個步驟循環30次,最后65 ℃延伸2 min,PCR體系見表2。將thl基因的PCR擴增產物與質粒pMTL82151進行雙酶切,用XbaⅠ和XhoⅠ限制性內切酶消化,并回收酶切產物。將thl基因與質粒pMTL82151連接,得到質粒pMTL82151-thl。將反應體系置于恒溫金屬浴中16 ℃恒溫反應過夜;然后進行大腸桿菌熱激轉化,取出感受態細胞,冰浴5 min,待其融化后,將連接產物全部加入感受態細胞中,輕柔混勻;冰浴30 min,42 ℃水浴熱激90 s,立刻置于冰浴8 min;加入900 μL新鮮的LB培養基,37 ℃溫和震蕩培養45 min～1 h;4000 r/min離心5 min,吸棄上清900 μL,剩下的液體與沉淀輕柔混勻;均勻涂布到有抗生素的篩選平板上,倒置培養過夜。對陽性克隆菌株送去北京擎科生物科技公司測序鑒定,并用質粒通用引物進行菌落PCR鑒定所得到的陽性克隆重組菌,電泳檢測菌落PCR鑒定結果。

1.2.4 菌絲霉素Pt基因克隆 根據Zasloff等[16]的研究,從NCBI數據庫上下載得到Pt基因,根據酪丁酸梭菌對密碼子偏愛性優化基因,然后設計4條引物合成,先使用Pt 2,3擴增,然后以其擴增產物為模板,利用Pt 1,4繼續擴增。PCR程序:98 ℃預變性2 min,變性(98 ℃,10 s)、退火(55 ℃,30 s)、延伸(68 ℃,20 s)三個步驟循環30次,最后65 ℃延伸2 min。PCR體系見表2。

表2 PCR反應體系Table 2 PCR reaction system

1.2.5 酪丁酸梭菌C.tyrobutyricum/pMTL82151-Pt的構建 將按照1.2.4中方法獲得的Pt基因的PCR擴增產物與質粒pMTL82151-thl進行雙酶切,分別用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶消化,并回收酶切產物。將Pt基因與質粒pMTL82151-thl連接,得到質粒pMTL82151-Pt。進行大腸桿菌熱激轉化,對陽性克隆菌株送北京擎科生物科技公司去測序鑒定,并用質粒通用引物進行菌落PCR鑒定所得到的陽性克隆。向5 mL RCM液體培養基中接種酪丁酸梭菌,37 ℃厭氧培養過夜,向5 mL LB 液體培養基中(30 μg/mL氯霉素),接種含質粒pMTL8-Pt的大腸桿菌CA434,37 ℃震蕩培養過夜;待大腸桿菌CA434的OD600值約為1.5時,4000 r/min離心2 min;去上清,加入1 mL PBS溶液懸浮沉淀,4000 r/min離心2 min,重復該步驟一次;加入200 μL PBS溶液懸浮沉淀,加入200 μL生長到OD600值約為1.5的酪丁酸梭菌混勻;混合物涂布RCM平板,37 ℃厭氧培養過夜;用1 mL PBS溶液吹打收集平板上的菌體,涂布到含有30 μg/mL甲砜霉素的RCM篩選平板上,37 ℃厭氧培養2～3 d;挑取單菌落進行菌落PCR和瓊脂糖凝膠電泳,確定陽性克隆,送測序并保存菌種(即突變株)。

1.2.6Pt基因在酪丁酸梭菌中的發酵表達 將陽性轉化子接種于含20 mL RCM(含30 μg/mL甲砜霉素)培養基的試管中,30 ℃、220 r/min搖床培養24 h。將20 mL菌液轉移至200 mL RCM培養基中,30 ℃、220 r/min繼續培養,共培養96 h。

1.2.7Pt組成型表達菌株的發酵產物測定 蛋白電泳:以濃度為300 μg/mL的菌絲霉素蛋白為標準品,取100 μL 1.2.6中發酵的發酵液上清溶液于小試管中,用0.22 μm微孔濾膜過濾,濾液用于SDS-PAGE電泳測定蛋白表達水平,10%分離膠,5%濃縮膠。樣品處理:2×加樣緩沖液按1∶1稀釋蛋白質樣品溶液,于100 ℃煮沸3～5 min。上樣:取處理后的樣品加入樣品池中,并加入20 μL低分子量蛋白Marker作對照。電泳:樣品在堆積膠階段電壓為80 V,在分離膠階段電壓調整為120 V,2.5 h。染色:將膠從玻璃板中取出,置于考馬斯亮藍染色液中染色,室溫4～6 h。脫色:將膠從染色液中取出,放入脫色液中,多次脫色至蛋白帶清晰。發酵液抑菌活性測定:以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為實驗菌株,將金黃色葡萄球菌懸浮液(OD600nm=0.5～0.6)50 μL與46 ℃的LB固體培養基100 mL混勻后鋪平板,待其凝固后4 ℃保存,用無菌打孔器打孔,每孔中滴加待測培養發酵液上清(發酵0、24、48、72、96 h)5 μL,待孔中液體被培養基吸收完全后,上述平板37 ℃倒置培養過夜(10～12 h)以同體積的無菌水培養上清為陰性對照,氨芐青霉素(Amp)為陽性對照。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0和Origin 8.0統計軟件,進行數據分析,所有數據值均用(mean±sd)表示,采用單因素方差分析,用于多組間或兩兩比較,P>0.05為無顯著統計學差異。采用ImageJ圖像處理軟件,對SDS-PAGE圖像結果估算出重組轉化子在發酵液上清中的最終表達量。

2 結果與分析

2.1 重組載體的構建與鑒定

用質粒通用引物進行菌落PCR鑒定所得到的陽性克隆。電泳檢測菌落PCR鑒定結果見圖2。圖3顯示得到約510 bp的基因片段,與預期大小510 bp相符。因此所得陽性克隆經測序結果正確,通過PCR方法獲得編碼菌絲霉素蛋白的DNA片段。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在142 bp附近得到目的條帶,與預期大小相符(圖4)。挑取抗性平板上的多拷貝轉化子,30 ℃、220 r/min,振蕩培養過夜,離心收集菌體提取重組質粒,并且對重組質粒酶切,結果如圖5所示:PCR鑒定所得到編碼重組蛋白菌絲霉素Pt基因序列與預期一致,即所挑取重組子呈陽性轉化子。

圖2 質粒pMTL82151-thl菌落PCR鑒定電泳檢測Fig.2 Plasmid pMTL82151-thl colony PCR identification electrophoresis detection注:泳道M為DNA Marker DL2000,泳道1～10為質粒pMTL82151-thl的大腸桿菌CA434陽性克隆株。

圖3 PCR擴增thl基因電泳分析Fig.3 PCR amplification of thl gene electrophoresis注:泳道M為DNA Marker DL2000,泳道1為thl基因條帶。

圖4 PCR擴增產物Fig.4 PCR amplification product注:M:DNA Marker DL2000,1:Pt。

圖5 重組質粒酶切產物Fig.5 Recombinant plasmid digestion product注:M:DNA Marker DL5000,1,2:重組質粒的酶切產物。

2.2 Pt在酪丁酸梭菌中表達

將上述PCR鑒定呈陽性的重組轉化子接種于含200 mL RCM(含30 μg/mL甲砜霉素),30 ℃、220 r/min繼續培養,培養96 h后,離心收集發酵液上清。發酵液上清的SDS-PAGE結果表明,重組轉化子培養上清在4.4 kDa處均有一明顯的蛋白條帶(圖6),通過對SDS-PAGE上的蛋白條帶用ImageJ估算軟件計算出重組轉化子在發酵液上清中的最終平均表達量為260.12 μg/mL(表3)。與PT的理論分子量一致。瓊脂孔穴擴散法測定重組轉化子發酵液上清中菌絲霉素的抗菌活性如圖7所示,使用Origin擬合標準曲線計算出IC50為12.74 μg/mL(表4),重組轉化子的發酵液上清中菌絲霉素對金黃色葡萄球菌ATCC 25923具有明顯的抑制作用。

圖6 發酵后酪丁酸梭菌重組表達菌絲霉素的發酵液電泳液Fig.6 Fermentation solution electrophoresis solution of Clostridium butyricum recombinantly expressing mycelia after induction注:M:Marker,1～5:重組菌發酵液上清中菌絲霉素,分別是2、2.5、3、3.5、4 μL；6～7:菌絲霉素標準品,分別是2、3 μL。

表3 發酵液上清的SDS-PAGE使用ImageJ估算分析Table 3 SDS-PAGE estimation of fermentation broth supernatant by ImageJ

圖7 酪丁酸梭菌重組表達菌株的發酵液抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of fermentation broth of Clostridium tyrobutyricum pMTL82151-Pt

表4 梯度濃度發酵液對金黃色葡萄球菌的抑制分析Table 4 Inhibition analysis of gradient concentration fermentation broth on Staphylococcus aureus

3 討論

本研究成功構建了一株酪丁酸梭菌表達菌絲霉素的工程菌,且在在菌絲霉素基因前加上強啟動子thl,很大程度上提高了菌絲霉素在工程菌中的產量,相比于Xiong等[17]的研究,Lima等將含有菌絲霉素NZ2114與親水性卷曲蛋白聚合物CP4融合體在畢赤酵母中分泌表達,制備完整的NZ2114-CP4聚合共聚物。他們雖然純化的NZ2114-CP4具有抗菌活性,IC50為33.56 μg/mL,其活性較低,而本研究中重組菌發酵產生的菌絲霉素IC50為12.74 μg/mL,具有較高的抗菌活性。Cai等[18]將菌絲霉素蛋白與小泛素樣修飾子(SUMO)融合在枯草芽孢桿菌中表達,麥芽糖利用操縱子Pglv誘導表達重組融合蛋白SUMO-plectasin。通過Ni-NTA樹脂柱純化并通過SUMO蛋白酶消化,最終蛋白表達量為0.14 g/L,而本研究為0.25 g/L。且Cai等[18]報道需要麥芽糖誘導枯草芽孢桿菌的表達,這樣無法直接使用在動物腸道內定植表達。本研究中所用的工程菌菌株,酪丁酸梭菌在腸道定植繁殖生長時的主要代謝產物為丁酸。丁酸可以作為小腸黏膜的主要能量來源,是腸道上皮組織細胞再生和修復的主要營養物質,對小腸的絨毛的修復起著重要的作用。且酪丁酸梭菌能影響動物腸道內菌群的豐度、多樣性以及組成[19-20]。現已證實,酪丁酸梭菌能增加腸道群落中乳酸桿菌屬和Faecalibaculum等有益菌群的物種豐度,降低韋榮球菌屬(Erysipelotrichaceae)等致病菌的物種豐度,具有調節腸道菌群,平衡腸道微生態的作用[21]。本研究已經成功在酪丁酸梭菌中高水平表達菌絲霉素蛋白,與其他工程菌株對比,腸道有益菌酪丁酸梭菌的優勢在于定植在腸道且表達菌絲霉素。

菌絲霉素在食品加工領域具有很強的潛在價值,菌絲霉素對人畜無害,可以直接做成食品抑菌添加劑,有非常廣闊的應用前景[22]。通過酪丁酸梭菌表達系統發酵表達菌絲霉素,重組菌發酵72 h后的發酵液對金黃色葡萄球菌的抑制率為68.74%,且IC50為12.74 μg/mL,該發酵培養簡單,周期短,成本低。為日后的規?；笊a和應用奠定基礎;也促使菌絲霉素成為新型天然食品添加劑[23],有力地保障食品加工和生產的安全。同時也為肉食類畜牧養殖中抗生素替代品[24]提供了更堅實的理論依據。