高產(chǎn)維生素K2菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化

杜亞飛,包瑞敏,包智影,張 智,*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

維生素K主要有兩種,分別為VK1(Phylloquinone,葉綠醌)和VK2(Menaquinone,甲萘醌類),VK1主要由植物產(chǎn)生,VK2主要由微生物產(chǎn)生[1]。維生素K1和維生素K3都要在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)換成VK2才能和腸道微生物合成的VK2一起發(fā)揮功能。VK2在食品中含量極少,有“鈾金維生素”之稱,可以預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松[2-3],它是一類具有相同2-甲基-1,4-萘醌環(huán)不同長度側(cè)鏈的系列衍生物[4],由于異戊二烯側(cè)鏈在C-3上的長度不同,VK2可以分為14種,分別以MK-n表示(其中n表示側(cè)鏈異戊二烯單位數(shù))。然而MK產(chǎn)量較高的菌種為數(shù)不多,能進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)MK的菌種主要是產(chǎn)MK-4革蘭氏陰性菌的產(chǎn)黃桿菌(FlauobacteriumSP.),以及產(chǎn)MK-7的革蘭氏陽性菌的枯草桿菌(Bacillussubtilis),本文中所用菌種為產(chǎn)MK-7的納豆菌。MK-7較MK-4半衰期長且功能廣泛,活性強(qiáng)大,作用持久[5]。日本關(guān)東地區(qū)居民的血液中 MK-7 含量與關(guān)西地區(qū)的相比要高得多,所以關(guān)東地區(qū)居民的股頸骨折發(fā)病率比關(guān)西居民低很多[6]。MK-7是哺乳動物產(chǎn)生凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ以及X的一個非常重要的輔因子,是正常血液凝固時不可或缺的營養(yǎng)素[7-8]。MK-7還能夠活化鈣化抑制基質(zhì)Gla蛋白質(zhì)(matrix Gla protein MGP),從而預(yù)防鈣質(zhì)在血管中沉淀,最終形成動脈硬化[9-10]。另外,MK-7 能夠?qū)⒐撬柚械墓氢}素活化,從而促進(jìn)骨頭的形成[11-12]。最近的流行病學(xué)研究表明,納豆中的MK-7能夠顯著提高老年人骨頭中的礦物質(zhì)密度(BMD),降低老年人的髖骨骨折風(fēng)險[13]。

維生素K被廣泛用于醫(yī)藥工業(yè)上。對微生物法生產(chǎn)VK2的研究主要體現(xiàn)在菌種的誘變和發(fā)酵條件的優(yōu)化上[8],但大部分對于納豆菌誘變的研究都只停留在菌種誘變方面[14-16],并沒有對營養(yǎng)型缺陷菌株進(jìn)行過研究。Yoshinori等[17]利用紫外(UV)物理誘變和亞硝基胍(NTG)化學(xué)誘變,抗性篩選得到高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌OUV23481,產(chǎn)量達(dá)到1719 μg/100 g,比出發(fā)菌株的產(chǎn)量增加了1倍。王萍等[18]通過響應(yīng)面的方法對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,VK2含量達(dá)到(2.2304±0.1115) μg/g。牟杰等[19]通過優(yōu)化VK2的高密度連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工藝,采用高密度連續(xù)發(fā)酵技術(shù),使5 L罐發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)35.58 mg/L。

通過調(diào)節(jié)微生物發(fā)酵的合成機(jī)制和合成途徑,選育出VK2高產(chǎn)菌株是發(fā)酵法的關(guān)鍵[20-22]。本實驗對納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)SD-3進(jìn)行DES誘變和紫外誘變[23-24]，利用VK2合成途徑中的反饋抑制對納豆芽孢桿菌SD-3進(jìn)行了L-Phe、L-Tyr以及L-Trp合成缺陷型選育,然后通過響應(yīng)面法對VK2的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌SD-3 由東北林業(yè)大學(xué)食品發(fā)酵實驗室分離保藏;完全培養(yǎng)基(CM) 酵母浸粉0.5%,胰蛋白胨0.1%,NaCl 0.1%,固體培養(yǎng)基另加2%瓊脂,0.1 MPa滅菌20 min;基本培養(yǎng)基(MM) 葡萄糖 2%,(NH4)2SO40.4%,KH2PO40.1%,MnSO4·H2O 0.01%,MgSO4·7H2O 0.04%,FeSO4·7H2O 0.01%;發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(FM) 葡萄糖15%,尿素0.8%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.1%,MnSO4·H2O 0.02%,MgSO4·7H2O 0.08%,FeSO4·7H2O 0.02%,0.5 mL 1%硫胺素,1.0 mL 0.15%生物素,固體培養(yǎng)基另加2%瓊脂,0.1 MPa滅菌20 min;選擇培養(yǎng)基 MM+(酪氨酸)Tyr、MM+(苯丙氨酸)Phe、MM+(色氨酸)Trp、MM+Tyr+Phe、MM+Tyr+Trp、MM+Tyr+Trp;硫胺素、生物素、苯丙氨酸、色氨酸 上海源葉生物科技有限公司;酪氨酸 中國惠世生化試劑有限公司;NaCl、(NH4)2SO4、KH2PO4、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、尿素 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;MgSO4·7H2O 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;硫酸二乙脂DES 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;正己烷 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;異丙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;青霉素鈉 上海源葉生物科技有限公司。

YXQG02手提式壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;SW-CJ-1G超凈工作臺 江蘇凈通凈化設(shè)備有限公司;JA2003型電子天平 上海精科儀器有限公司;DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;722s可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;酵母浸粉、胰蛋白胨、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡萄糖 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將在保存在-80 ℃冰箱中菌株解凍復(fù)蘇,接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24 h,然后接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.2 液體種子培養(yǎng) 挑取一環(huán)活化后斜面培養(yǎng)基中的菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中,250 mL三角瓶,裝液量100 mL,溫度37 ℃ 120 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.3 誘變方法

1.2.3.1 生長曲線的繪制 配制液體完全培養(yǎng)基分裝于3個250 mL三角瓶中,每瓶裝液量為100 mL,121 ℃,20 min滅菌,接種量2%,37 ℃ 120 r/min的搖床中培養(yǎng),每隔2 h在600 nm下測定OD值。用無菌液做為對照,用菌液培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制菌體的生長曲線。

1.2.3.2 菌懸液的制備 取對數(shù)期種子液,4000 r/min離心5 min收集菌體,棄上清液并用滅菌后的生理鹽水清洗兩次,得到菌懸液,將菌數(shù)調(diào)整到105～106CFU/mL備用。

1.2.3.3 物理誘變 取1.2.3.2中所制備的菌懸液10 mL淺層平鋪于直徑9 cm無菌培養(yǎng)皿中,在距離15 W紫外燈一定距離處,照射一定時間,開始照射時啟動計時。將處理后的菌液涂平板,每組做3次平行。將涂好的平板用黑布包裹嚴(yán)實,37 ℃倒置培養(yǎng)48 h,確定致死率。

1.2.3.4 DES誘變 取1 mL菌懸液4000 r/min離心5 min,保留菌體,離心洗滌2次,使細(xì)胞懸浮于0.1 mol/L無菌磷酸緩沖溶液(pH7.0)中,加入DES溶液,使誘變劑的達(dá)到一定的終質(zhì)量分?jǐn)?shù),用無誘變劑的磷酸緩沖溶液作為對照。振蕩后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間,培養(yǎng)結(jié)束立即加入0.5 mL 25% NaS2SO3,稀釋涂平板,每組做3次平行,37 ℃培養(yǎng)48 h后計算致死率。

1.2.3.5 致死率的測定 將未經(jīng)誘變處理的菌液(A)與在不同梯度下誘變處理的菌液(B)適當(dāng)稀釋后,涂布于固體培養(yǎng)基上計算菌落數(shù)[25],取致死率為60%～90%之間的組別進(jìn)行下一步實驗。

1.2.4 菌種誘變單因素實驗

1.2.4.1 紫外照射距離對納豆芽孢桿菌SD-3的影響 按照1.2.3.2所述方法獲得菌懸液,取菌懸液10 mL淺層平鋪于直徑9 cm無菌培養(yǎng)皿中,分別在距離15 W紫外燈10、15、20、25、30 cm處,照射40 s,開始照射時啟動計時。將處理后的菌液涂平板,每組做3次平行。將涂好的平板用黑布包裹嚴(yán)實,37 ℃倒置培養(yǎng)48 h,確定致死率。

1.2.4.2 紫外照射時間對納豆芽孢桿菌SD-3的影響 按照1.2.3.2所述方法獲得菌懸液,取菌懸液10 mL淺層平鋪于直徑9 cm無菌培養(yǎng)皿中,在距離15 W紫外燈30 cm處,分別照射0、20、40、60、80、100 s,開始照射時啟動計時。將處理后的菌液涂平板,每組做3次平行。將涂好的平板用黑布包裹嚴(yán)實,37 ℃倒置培養(yǎng)48 h,確定致死率。

1.2.4.3 DES濃度對納豆芽孢桿菌SD-3的影響 取1 mL對數(shù)期發(fā)酵液4000 r/min離心5 min,保留菌體,離心洗滌2次,使細(xì)胞懸浮于0.1 mol/L無菌磷酸緩沖溶液(pH7.0)中,加入DES溶液,使誘變劑的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%、2%、3%、4%、5%。振蕩后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min,培養(yǎng)結(jié)束立即加入0.5 mL 25% NaS2SO3,稀釋涂平板,每組做3次平行,37 ℃培養(yǎng)48 h后計算致死率。

1.2.4.4 DES處理時間對納豆芽孢桿菌SD-3的影響 取1 mL對數(shù)期發(fā)酵液4000 r/min離心5 min,保留菌體,離心洗滌2次,使細(xì)胞懸浮于0.1 mol/L無菌磷酸緩沖溶液(pH7.0)中,加入DES溶液,使誘變劑的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,振蕩后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、15、30、45、60、75 min,培養(yǎng)結(jié)束立即加入0.5 mL 25% NaS2SO3,稀釋涂平板,每組做3次平行,37 ℃培養(yǎng)48 h后計算致死率。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)方法 將新鮮發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基置于120 ℃,滅菌20 min,接入體積分?jǐn)?shù)2%活化后的原始菌株SD-3,37 ℃ 120 r/min搖床培養(yǎng)24 h后,測定發(fā)酵液中VK2含量。

1.2.6 VK2的提取與測定 VK2為脂溶性維生素,并且主要在細(xì)胞內(nèi)累積,因此一般采用有機(jī)溶劑萃取的方法進(jìn)行提取。將培養(yǎng)后的發(fā)酵液于8000 r/min條件下離心5 min。棄掉上清液,將所得菌體用15 mL蒸餾水制成菌懸液后進(jìn)行超聲破碎5 min,破碎完畢后加入15 mL正己烷劇烈震蕩2 min,然后于8000 r/min條件下離心5 min。在248 nm處測吸光值,利用標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算目標(biāo)產(chǎn)物的含量,同時用空白樣作對照實驗[26]。

1.2.7 營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出與篩選

1.2.7.1 饑餓培養(yǎng) 將5 mL誘變后的菌液4000 r/min離心5 min,無菌生理鹽水離心洗滌三次,接入不含氮源的基本培養(yǎng)基中,使細(xì)菌細(xì)胞從完全培養(yǎng)基吸收的氮源成分得以充分消耗。

1.2.7.2 青霉素處理淘汰野生型菌株 向無氮培養(yǎng)基中補(bǔ)加等體積的二倍氮源高滲培養(yǎng)基,向其中加入青霉素鈉鹽,并使青霉鈉鹽終濃度為100 μg/mL,37 ℃ 120 r/min培養(yǎng)1.0～1.5 h,離心,洗滌3次,備用,稀釋涂布于MM+Phe、MM+Tyr、MM+Trp、MM+(Phe,Tyr)、MM+(Tyr,Trp)、MM+(Phe,Trp)、MM+(Phe,Tyr,Trp)(100 μg/mL)培養(yǎng)基平板。

1.2.7.3 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選 將培養(yǎng)基中的單菌落用無菌牙簽依次在MM培養(yǎng)基和MM+(Phe,Tyr)、MM+(Tyr,Trp)、MM+(Phe,Trp)、MM+(Phe,Tyr,Trp)(100 μg/mL)培養(yǎng)基上對每一個單菌落進(jìn)行點種,對應(yīng)的培養(yǎng)皿中菌落須一一對應(yīng),并且進(jìn)行編號。菌株在MM+(Phe,Trp)上生長,其他補(bǔ)充培養(yǎng)基上不生長,即成功篩選出一株苯丙氨酸和色氨酸雙重營養(yǎng)缺陷型菌株。

1.2.7.4 遺傳穩(wěn)定性實驗 將補(bǔ)充培養(yǎng)基中的突變株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,共傳代5代,同時對五代的菌株均進(jìn)行液體培養(yǎng),選出產(chǎn)VK2最多的菌株。

1.2.8 發(fā)酵工藝單因素實驗

1.2.8.1 裝液量對納豆芽孢桿菌PT-6產(chǎn)VK2的影響 將培養(yǎng)的菌液按3%接種于分別裝有25、50、75、100、125 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h,測VK2含量。

1.2.8.2 接種量對納豆芽孢桿菌PT-6產(chǎn)VK2的影響 將培養(yǎng)的菌液分別按1%、2%、3%、4%、5%、6%接種于裝有50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h,測VK2含量。

1.2.8.3 溫度對納豆芽孢桿菌PT-6產(chǎn)VK2的影響 將培養(yǎng)的菌液按3%接種于裝有50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,發(fā)酵溫度分別為 22、27、32、37、42 ℃,置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h,測VK2含量。

1.2.9 響應(yīng)面法優(yōu)化VK2的發(fā)酵條件 應(yīng)用Design-Expert軟件中的Box-Benhnken設(shè)計構(gòu)建模型,響應(yīng)面法尋找最佳發(fā)酵條件。以裝液量(A)、接種量(B)、溫度(C),3個因素為自變量,VK2產(chǎn)量為響應(yīng)值,運(yùn)用三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗,共17個試驗點。試驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件中的One-way analysis of vari-ance計算標(biāo)準(zhǔn)差。采用 Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SD-3生長曲線的測定

SD-3的生長曲線見圖1,由圖1可知,5～15 h為SD-3的對數(shù)生長期,該時期的菌種生長最旺盛,突變率高,重現(xiàn)性好。因此,選用對數(shù)生長期的SD-3進(jìn)行菌種誘變。

圖1 納豆芽孢桿菌SD-3的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus natto SD-3

2.2 DES和紫外對SD-3誘變條件的優(yōu)化

菌種誘變時需要取對數(shù)期的菌體,此時細(xì)胞生長旺盛,幾乎全部為營養(yǎng)細(xì)胞,突變率較高。由圖2a可知,納豆芽孢桿菌SD-3的致死率隨著紫外照射距離的增大而減小,紫外照射距離小于25 cm時菌種致死率過高,正突變率太低,而紫外照射距離大于25 cm時,致死率較低,此時正突變率也較低。因此,紫外照射距離為25 cm時,誘變效果最好。由圖2b可知,納豆芽孢桿菌SD-3的致死率隨著紫外照射時間的增大而增大,當(dāng)照射時間達(dá)到60 s時,SD-3的致死率大于90%,誘變效果較差,當(dāng)照射時間小于40 s時,SD-3的致死率低于80%,此時正突變率太低。故選擇紫外照射距離為25 cm,照射時間為50 s,此時誘變效果最好。

圖2 DES和紫外照射對納豆芽孢桿菌SD-3的影響Fig.2 Effects of DES and UV irradiation on Bacillus natto SD-3

由圖2c、圖2d可知,SD-3的存活率隨DES誘變時間的延長和DES質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而降低。用2% DES處理SD-3時,其致死率大于80%,小于90%,此時正突變率較高。DES質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定不變(1%),處理時間為60 min時,SD-3的致死率在80%～90%之間,當(dāng)處理時間為70 min時,致死率大于90%,此時正突變率太低。根據(jù)誘變育種的經(jīng)驗和研究可知[27-29],致死率在80%～90%左右獲得正突變株的幾率最高,因此DES處理SD-3的條件應(yīng)為2% DES,反應(yīng)60 min。

2.3 營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出與篩選

2.3.1 納豆芽孢桿菌SD-3營養(yǎng)缺陷型菌株的選育 將涂布于補(bǔ)充培養(yǎng)基平板中用無菌牙簽挑取36個菌落,圖3可知,在MM上不生長,在MM+(Phe,Trp)生長良好的菌株即為苯丙氨酸和色氨酸雙重營養(yǎng)缺陷型菌株。

圖3 營養(yǎng)缺陷性菌株的初篩結(jié)果Fig.3 Screening of auxotrophic strains注:a:MM+(Phe,Trp)培養(yǎng)基;b:MM培養(yǎng)基;圖5同。

由圖4可知,乙酰CoA是異戊二烯側(cè)鏈合成的起始化合物,經(jīng)過甲羥戊酸、異戊烯焦磷酸、牛兒基香葉基焦磷酸等中間物質(zhì),合成側(cè)鏈聚異戊二烯焦磷酸;而萘醌母環(huán)是從4-磷酸赤蘚糖開始,經(jīng)過莽草酸、分枝酸、異分枝酸、2-琥珀酰-6-羥基-2,4-環(huán)己二烯-1-羥酸(SHCHC)以及鄰苯甲酸(OSB)等中間化合物合成;萘醌母環(huán)和側(cè)鏈經(jīng)酶催化合成后再經(jīng)過一步甲基化反應(yīng)就合成了最終的VK2[30]。

圖4 萘醌(VK2)的生物合成途徑及芳香族氨基酸的反饋抑制Fig.4 Biosynthesis pathway of naphthoquinone(VK2)and feedback inhibition of aromatic amino acids

在VK2的生物合成途徑中,分枝酸是合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸3種芳香族氨基酸的前體物質(zhì),因此甲萘醌母環(huán)的合成會受到這3種氨基酸的反饋抑制。本實驗在VK2的生物合成途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上,依據(jù)遺傳育種理論,利用此合成途徑中的反饋抑制對納豆芽孢桿菌SD-3進(jìn)行L-Phe、L-Tyr以及L-Trp合成缺陷型選育,得到了一株[Phe,Trp]-菌株,即破壞了VK2合成途徑中的苯丙氨酸以及色氨酸路徑的反饋抑制,從而提高了萘醌母環(huán)的合成量,達(dá)到了提高VK2產(chǎn)量的目的。

2.3.2 納豆芽孢桿菌SD-3營養(yǎng)缺陷型菌株的復(fù)篩 將誘變后所得菌株在MM+(Phe,Trp)斜面上傳代培養(yǎng)5次后,再用劃線對照法檢測其穩(wěn)定性,結(jié)果見圖5。從圖5可看出,接種在平板4、6區(qū)的2個菌株,在MM+(Phe,Trp)上生長良好,而在MM上不生長,可初步判斷為[Phe,Trp]-菌株,分別編號為PT-4、PT-6。

圖5 營養(yǎng)缺陷型菌株的復(fù)檢Fig.5 Retest results of auxotrophic strains

2.3.3 VK2含量測定 由表2可知,篩選出的3株缺陷型菌株的VK2產(chǎn)量較原始菌株的產(chǎn)量有不同程度的提高。經(jīng)過DES和紫外照射得到的菌株P(guān)T-6經(jīng)5次傳代并發(fā)酵培養(yǎng)后的VK2的平均產(chǎn)量達(dá)到40.23 mg/L相較于出發(fā)菌株SD-3的VK2產(chǎn)量(21.86 mg/L)提高了84.03%。也進(jìn)一步說明通過切斷L-Phe、L-Trp的代謝支路途徑,可有效提高VK2的產(chǎn)量。

表2 野生型與缺陷型菌株的VK2產(chǎn)量Table 2 The yield of VK2 of wild type and auxotrophic strains

2.4 發(fā)酵條件單因素試驗

2.4.1 裝液量對VK2含量的影響 由圖6可知,VK2的產(chǎn)量隨著裝液量的增大呈先增大后減小的趨勢,當(dāng)裝液量為50 mL時,VK2的產(chǎn)量最高。可能是由于PT-6為需氧菌,裝液量過大會導(dǎo)致溶氧量低,裝液量過小會由于發(fā)酵過程中水分蒸發(fā)導(dǎo)致菌體早衰,不利于VK2的形成,故選擇裝液量50 mL為零水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖6 裝液量對VK2含量的影響Fig.6 Effect of liquid medium volume on VK2 production

2.4.2 接種量對VK2含量的影響 由圖7可知,VK2的產(chǎn)量隨著接種量的增大呈先增大后減小的趨勢,當(dāng)接種量為3%時,VK2的產(chǎn)量最高。這可能是因為當(dāng)接種量過大會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)快速消耗,接種量過小會影響菌體內(nèi)某些輔酶擴(kuò)散,都不利于VK2的合成,故選擇接種量3%為零水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖7 接種量對VK2含量的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on VK2 production

2.4.3 溫度對VK2含量的影響 由圖8可知,VK2的產(chǎn)量隨著溫度的增大呈先增大后減小的趨勢,溫度為37 ℃時,VK2含量最高,溫度大于或小于37 ℃時VK2含量都不高,這可能是由于當(dāng)溫度小于37 ℃時菌體生長較緩慢,而大于37 ℃時雖然菌體生長迅速,但提早進(jìn)入衰亡期,近而影響VK2的產(chǎn)量。故選擇溫度37 ℃為零水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖8 溫度對VK2含量的影響Fig.8 Effect of temperature on VK2 production

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化VK2的發(fā)酵條件

2.5.1 Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果與回歸模型的方差分析 以裝液量(A)、接種量(B)、溫度(C)為考察因素,以VK2含量為響應(yīng)值,運(yùn)用 Box-Benhnken 設(shè)計17組試驗,Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

利用Design Expert軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到模型的二次回歸方程:

表3 Box-Benhnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experiment design and results of BBD

Y=52.32-0.53A+0.49B+0.076C+0.18AB+0.41AC+0.12BC-1.76A2-2.02B2-1.58C2

式中:Y:VK2的含量(mg/L);A、B、C:分別代表裝液量(mL)、接種量(%)和溫度(℃)。

回歸模型的方差分析結(jié)果見表4。回歸模型P<0.0001,表明回歸模型達(dá)極顯著水平;失擬項P=0.8205,不顯著,說明該模型成立。回歸模型中一次項A、B、交互項AC對Y值影響顯著,A2、B2、C2對Y值影響極顯著,其余項不顯著;R2=0.9876線性關(guān)系明顯,說明響應(yīng)值的變化有98.76%來源于所選變量,得到模型擬合程度好,實驗誤差小,可運(yùn)用該回歸方程對試驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)for the quadratic model

2.5.2 響應(yīng)面曲線及等高線分析 通過等高線和響應(yīng)面圖可以直觀地看出各個因素間的相互作用,反應(yīng)各自變量對響應(yīng)值的影響。固定裝液量、接種量、溫度其中任意一個因素,繪制另兩個因素之間交互作用的等高線和響應(yīng)面圖,見圖9。等高線形狀若趨于橢圓形,則兩自變量之間交互作用明顯,趨于圓形則反之;等高線密度大,表明因素間交互作用較強(qiáng)。響應(yīng)面曲面的傾斜度越高,即坡度越陡,說明因素間交互作用越顯著,隨著變化趨勢的劇烈增加,曲面顏色也呈加深趨勢。由圖9可以看出,裝液量(A)和溫度(C)交互作用顯著,裝液量(A)和接種量(B)、接種量(B)和溫度(C)交互作用不顯著,與表4中方差分析結(jié)果一致。

圖9 裝液量、接種量、溫度交互作用對VK2含量影響的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.9 Response surface plots and contour line of effects of interaction between liquid medium volume,inoculation amount and temperature on VK2 production

2.5.3 VK2發(fā)酵工藝條件的確定及回歸模型的驗證試驗 利用Design-Expert 8.0.6分析得到VK2的最佳發(fā)酵工藝條件理論值為:裝液量63.75 mL,接種量3.08%,溫度37.6 ℃,理論VK2含量可高達(dá)51.5976 mg/L。考慮到實驗操作的可行性將最佳發(fā)酵工藝條件調(diào)整為:裝液量64 mL,接種量3%,溫度38 ℃,經(jīng)過3次平行試驗,測得實際VK2含量為51.23 mg/L，與理論值相差較小,說明通過響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵條件參數(shù)可靠,具有一定的實踐指導(dǎo)價值，且VK2的最終產(chǎn)量相較初始菌株SD-3提高了134.35%。

3 結(jié)論

本實驗首先以納豆芽孢桿菌SD-3為出發(fā)菌株,采用DES誘變和紫外誘變的方法構(gòu)建VK2高產(chǎn)菌株。DES誘變處理最佳條件為DES質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,反應(yīng)時間60 min,紫外誘變最佳條件為照射距離25 cm,照射時間50 s。經(jīng)過多次篩選最終獲得1株具有分枝酸-Trp/Phe/Tyr代謝途徑,Phe-和Trp-合成缺陷的雙重營養(yǎng)缺陷型VK2高產(chǎn)菌株P(guān)T-6;連續(xù)傳代5次,同時對五代的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng),VK2的發(fā)酵產(chǎn)率平均達(dá)到40.23 mg/L,較出發(fā)菌株產(chǎn)VK2水平(21.86 mg/L)提高84.03%,然后考察了裝液量、接種量、溫度3個因素對VK2含量的影響,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了VK2發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件為:裝液量64 mL,接種量3%,溫度38 ℃,在此優(yōu)化條件下VK2含量達(dá)到了51.23 mg/L。本實驗表明菌種誘變選育出的高產(chǎn)菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性,通過響應(yīng)面法對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后顯著提高了VK2含量,為工業(yè)上生產(chǎn)VK2提供參考依據(jù),具有一定的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。