基于乳清蛋白粉水解產物抗氧化活性優化酶解工藝

邵志芳,皇甫潔,劉文穎,吳培涵,董建輝,裴疆森,王德良,*

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.中國食品發酵工業研究院有限公司,北京 100015)

乳清蛋白粉是干酪及干酪素加工過程中的副產品,廉價易得。其中乳清蛋白包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛乳血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白及乳過氧化物酶等,富含必需氨基酸,且脂肪、膽固醇和乳糖含量較低,具有大量可以提高吸收的功能性成分的特點,營養價值極高[1-3]。隨著乳源性抗氧化肽研究的逐漸深入,研究者們在乳清蛋白中發現了具有抗氧化活性的肽段,與化學合成的抗氧化劑相比,無論從安全性還是營養性,以乳清蛋白多肽制備食品抗氧化劑更有優勢[4-6]。

乳清蛋白的抗氧化活性來源于其水解產物[7],集中體現在一級結構的低分子質量短肽中[8-9],采用特定方法處理乳清蛋白可以將具有抗氧化活性的小分子肽段釋放出來[10],比如酶解法[11-12]和微生物發酵法[13]。酶解法反應條件溫和、效率髙,酶的來源相對廣泛,反應過程易控制,因此被廣泛采用[14-17]。不同的蛋白酶和反應條件(pH、溫度、底物濃度、酶底比、反應時間)會產生含有不同肽段和不同抗氧化活性的水解產物,Maux等[18]發現用木瓜蛋白酶水解濃縮乳清蛋白粉時,pH為7時水解產物的抗氧化活性最高。Peng等[19]研究了水解時間對水解產物抗氧化活性的影響,發現過長的水解時間會導致水解出過多的游離氨基酸,從而導致抗氧化活性降低。但是,已有研究多是采用單一蛋白酶進行酶解,受酶解工藝影響,乳清蛋白粉水解物抗氧化活性不高,不足以達到工業應用要求。

本研究篩選2種蛋白酶復合協同水解乳清蛋白粉,以WPPH的抗氧化活性為指標,從蛋白酶種類選擇、加入方式、酶解條件等方面對復合蛋白酶協同水解乳清蛋白粉的工藝進行優化,為乳清蛋白粉高效制備技術提供理論依據和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

WPC80乳清蛋白粉 江蘇普新生物科技有限公司;堿性蛋白酶(200000 U/g)、胰蛋白酶(4000 U/g)、菠蘿蛋白酶(1200000 U/g)、木瓜蛋白酶(600000 U/g) 南寧東恒華道生物科技有限責任公司;總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS快速法) 碧云天生物技術研究所;DPPH(>90%)、三氯乙酸、四種分子量肽標準品(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451 Da)、桿菌酶(分子量1450 Da)和細胞色素C(分子量12500 Da))、鄰苯三酚、三氯乙酸 美國Sigma公司;乙腈、三氟乙酸 英國Alfa Aesar公司;其他試劑 均為國產分析純。

UV-1780紫外分光光度計 日本島津公司;MultiskanTMFC酶標儀 美國Thermo Scientific公司;HJ-4A多頭電磁攪拌器 常州潤華電器有限公司;GSY-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋 北京市醫療設備廠;pH計 瑞士METTLER TOLEDO公司;2-16N高速微量離心機 恒諾儀器設備;LC-20A 高效液相色譜儀 日本SHIMADZU公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳清蛋白粉酶解過程 稱取適量的乳清蛋白粉溶解于去離子水中,配制成一定底物濃度(w/V)的溶液,95 ℃水浴5 min后冷卻至一定的蛋白酶適宜溫度(并在整個酶解過程中保持溶液溫度變化不超過±1 ℃),置于恒溫電磁攪拌器上,用0.5 mol/L的NaOH調節溶液pH至一定值,按照一定的酶底比(w/w)加入蛋白酶,進行酶解反應一定時間,反應過程每隔10 min向酶解液中加入0.5 mol/L的NaOH溶液保證pH的變化不超過±0.05。酶解結束后,沸水浴滅酶10 min,冷卻至室溫,即得到乳清蛋白粉水解產物(Whey protein powder hydrolysate,WPPH),5000 r/min離心分離15 min,取上清液備用[20]。

1.2.2 蛋白酶的篩選 采用1.2.1的酶解方法,各蛋白酶在各自最適的酶解條件下(4種酶的最適酶解條件見表1),對乳清蛋白粉進行酶解,分別以WPPH的水解度、抗氧化能力(DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力)為評價指標,從四種蛋白酶中篩選出酶解效果最好的兩種蛋白酶。

表1 4種蛋白酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of four kinds of protease

1.2.3 水解度的測定 WPPH中游離氨基氮含量的測定采用中性甲醛電位滴定法[20]。采用凱氏定氮法測定乳清蛋白粉中總氮的含量[21]。

1.2.4 抗氧化活性檢測

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測定 采用Larrauri等[23]的方法并稍作改進。以無水乙醇為溶劑,配制DPPH的濃度為0.1 mmol/L。取2 mL試樣與2 mL DPPH無水乙醇溶液混合,并劇烈振蕩,在室溫下避光反應30 min,然后在517 nm處測定其吸光值Ai?？瞻捉M以等體積無水乙醇溶液替代DPPH溶液,對照組以等體積蒸餾水替代樣品溶液。DPPH自由基清除率用下式計算:

式中:A0表示對照組吸光度;Ai表示樣品組吸光度;Aj表示空白組吸光度。

1.2.4.2 羥自由基清除能力測定 采用Oyaizu[24]的方法,并略加改動。取2 mL酶解液,加入到2 mL濃度9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2 mL濃度10 mmol/L的過氧化氫水溶液,搖勻,37 ℃靜置10 min,加入2 mL濃度9 mmol/L的水楊酸溶液,混合后37 ℃靜置30 min于510 nm處測吸光度值,計算公式為:

式中:A0表示不加樣品的吸光度值;Ai表示加入樣品的吸光度值;Aj表示無顯色劑時樣品的本底值。

1.2.4.3 總抗氧化能力測定 使用總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS快速法)[25]。ABTS工作液配制后,室溫避光保存,宜在30 min內使用完畢。96孔板的每個檢測孔中加入20 μL過氧化物酶工作液;空白對照孔中加入10 μL蒸餾水,標準曲線檢測孔內加入10 μL各種濃度的Trolox標準溶液,樣品檢測孔內加入10 μL各種樣品。輕輕混勻;每個孔內加入170 μL ABTS工作液,輕輕混勻;室溫孵育6 min后測定A450;根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。

1.2.5 單因素實驗 分別按照胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解基礎條件:胰蛋白酶酶解最適pH6.5,菠蘿蛋白酶酶解最適pH6.0,反應溫度50 ℃,底物濃度3 g/100 mL,酶底比0.3%,水解時間2 h,以WPPH的水解度、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力為評價指標,分別考察各單因素對水解效果的影響,單因素試驗水平表見表2。

表2 單因素試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of single-factor test

1.2.6 復合酶加酶方式實驗 根據單因素實驗結果,將胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶按照1∶1的比例進行復配,復合酶加入方式見表3,以胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶的單因素實驗結果設定酶解條件為,pH6.25,溫度50 ℃,底物濃度3.5 g/100 mL,酶底比0.3%,酶解時間2.5 h,分別以WPPH的水解度、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力為指標,篩選出兩種蛋白酶的最佳加入方式。

表3 復合酶加入方式實驗設計Table 3 Experimental design of adding way of complex enzyme

1.2.7 正交實驗 根據單因素及復合酶加入方式實驗結果,以pH、酶解溫度、底物濃度、酶底比為影響因素,以水解度、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力、還原能力為指標,對復合酶水解乳清蛋白粉工藝進行L9(34)正交實驗進行優化,因素水平設計見表4。

表4 L9(34)正交實驗因素水平表Table 4 Design of factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.8 WPPH分子量分布 采用高效液相凝膠色譜法(HPLC)對最優工藝條件下得到的WPPH分子量分布情況進行測定。色譜柱:TSKgel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm);流動相乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1 (V/V);流速0.5 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長220 nm;柱溫30 ℃。將樣品溶解于流動相并過膜,用高效液相色譜儀進行凝膠過濾,紫外檢測器進行檢測,最后使用GPC軟件對色譜數據進行處理。以四種肽標準品做相對分子質量標準曲線。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

蛋白酶的專一性決定了其具有特定的水解位點,并且不同蛋白酶對底物蛋白水解所得的酶解物的種類和抗氧化活性都是不同的,同種底物經不同的蛋白酶水解也會得到氨基酸組成及排列順序、分子量大小、肽構象、活性等都不同的多肽。由圖1可知在胰蛋白酶作用下WPPH的水解度最高,菠蘿蛋白酶次之;在菠蘿蛋白酶作用下WPPH抗氧化活性最高,胰蛋白酶次之,綜合考慮水解度及抗氧化活性,選擇胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶為實驗用酶。

圖1 不同蛋白酶對WPPH水解度及抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of different protease on hydrolysis degree and antioxidant activity of WPPH

2.2 單因素實驗

2.2.1 pH對蛋白酶酶解效果的影響 每種蛋白酶都有其最適pH,在酸堿不適宜的情況下蛋白酶的空間構型會產生變化,從而導致酶或降低甚至失活。由圖2可知,pH變化對胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶的水解效果均有明顯影響:對于胰蛋白酶,WPPH的抗氧化活性隨著pH增加而增強,當pH6.5時達到最高,之后隨著pH增加抗氧化活性下降,WPPH的水解度隨著pH升高而增加,至pH7.5時水解度達到最高。對于菠蘿蛋白酶,WPPH的抗氧化活性隨著pH增加而增強,當pH6.0時達到最高,之后隨著pH增加抗氧化活性下降,WPPH的水解度隨著pH升高而增加,至pH6.5時水解度達到最高。水解度與抗氧化性沒有呈現出正相關性,即只有在特定的水解度條件下,酶解液的抗氧化性最強。可能是因為水解度過小,具有抗氧化性的肽片段沒有完全的暴露出來,抗氧化性較弱;水解度過大時,深度水解使得抗氧化肽被降解成游離的氨基酸,破壞了抗氧化肽的結構,從而呈現出了水解度增大抗氧化活性減小的趨勢[10]。本研究旨在提高WPPH的抗氧化活性,故胰蛋白酶的最適pH選擇6.5,菠蘿蛋白酶的最適pH選擇6.0。

圖2 pH對蛋白酶水解效果的影響Fig.2 Effect of pH on the hydrolysis of protease注:A:pH對胰蛋白酶水解效果的影響;B:pH對菠蘿蛋白酶水解效果的影響。

2.2.2 溫度對蛋白酶酶解效果的影響 每種酶發揮其活性都有最適的溫度,溫度低于其最適溫度時,酶活被抑制不能發揮其活性;溫度高于其最適溫度時,酶結構被破壞而失去活性。由圖3可知,當溫度低于50 ℃時,兩種蛋白酶的WPPH的抗氧化活性隨著溫度升高而升高,當溫度高于50 ℃時,WPPH的抗氧化活性隨著溫度升高而降低,故兩種蛋白酶的最佳酶解溫度確定為50 ℃。

圖3 溫度對蛋白酶水解效果的影響Fig.3 Effect of temperature on the hydrolysis of bromelain注:A:溫度對胰蛋白酶水解效果的影響;B:溫度對菠蘿蛋白酶水解效果的影響。

2.2.3 底物濃度對蛋白酶酶解效果的影響 隨著底物濃度的增加,兩種蛋白酶的WPPH抗氧化活性均呈現先升高后下降的趨勢,底物濃度4 g/100 mL時胰蛋白酶的WPPH抗氧化活性達到最高,底物濃度3 g/100 mL時菠蘿蛋白酶的WPPH抗氧化活性達到最高,故胰蛋白酶的最適底物濃度選擇4 g/100 mL,菠蘿蛋白酶的最適底物濃度選擇3 g/100 mL。

2.2.4 酶底比對蛋白酶酶解效果的影響 由圖5可知,當酶底比小于0.30%時,兩種蛋白酶的WPPH水解度及抗氧化活性樣品隨著蛋白酶添加量增加而增強。酶底比在0.30%以上時,WPPH的水解度繼續增加而抗氧化活性趨于穩定甚至是略有下降,說明酶底比在0.30%時蛋白酶對底物的酶解效果接近飽和,繼續增大酶用量可以使WPPH的水解度提高,但同時也會使WPPH中的抗氧化活性肽發生降解,因此,最適酶底比確定為0.30%。

圖4 底物濃度對蛋白酶水解效果的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on protease hydrolysis注:A:底物濃度對胰蛋白酶水解效果的影響;B:底物濃度對菠蘿蛋白酶水解效果的影響。

圖5 酶底比對蛋白酶水解效果的影響Fig.5 Effect of the ratio of enzyme to substrate on the hydrolysis of protease注:A:酶底比對胰蛋白酶水解效果的影響;B:酶底比對菠蘿蛋白酶水解效果的影響。

2.2.5 酶解時間對蛋白酶酶解效果的影響 由圖6可知,酶解開始階段,WPPH水解度及抗氧化活性上升較快,當反應時間達到2.5 h時,兩種蛋白酶WPPH抗氧化活性均達到最高,水解度變化趨于平緩,從節約時間和節約能源角度考慮,確定最佳酶解時間為2.5 h。

圖6 酶解時間對蛋白酶水解效果的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on the hydrolysis of bromelain注:A:酶解時間對胰蛋白酶水解效果的影響;B:酶解時間對菠蘿蛋白酶水解效果的影響。

2.3 復合酶加酶方式實驗結果分析

由2.1單因素實驗結果可知,胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶的最佳酶底比均為0.3%,故將這兩種蛋白酶按照1∶1的比例進行復配,酶解時間固定為2.5 h,進一步優化酶解條件,提高WPPH的抗氧化活性。

由表5數據可知,實驗1即胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶的乳清蛋白酶水解產物抗氧化活性最高,胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶同時添加為最佳方式,以下實驗均采用此加酶方法。

表5 復合酶加入方式對酶解效果的影響Table 5 Effect of complex enzymes addition on enzymatic hydrolysis

2.4 正交實驗設計及結果

表6可知,影響乳清蛋白酶水解產物抗氧化活性的各因素之間的主次關系為:以水解度為指標時,pH>酶解溫度>底物濃度>酶底比,最優方案為A3B3C1D3;以DPPH自由基清除率為指標時,酶解溫度>pH>酶底比>底物濃度,最優方案為A1B2C1D3;羥自由基清除率為指標時,酶解溫度>pH>酶底比>底物濃度,最優方案為A1B2C1D2;以總抗氧化能力為指標時,酶解溫度>pH>底物濃度>酶底比,最優方案為A1B2C3D1。

2.5 最佳酶解條件的確定

由表7可知,pH、酶解溫度、酶底比、底物濃度對水解度的影響均不顯著,在確定酶解條件時優先考慮酶解條件對WPPH抗氧化活性的影響。pH對DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力的影響顯著,根據此三個指標的最優方案確定最佳酶解pH為6.0;酶解溫度對DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力影響顯著,根據此三個指標的最優方案確定最佳酶解溫度為50 ℃;酶底比對DPPH自由基清除率影響顯著,對羥自由基清除率、總抗氧化能力的影響不顯著,優先考慮酶底比對DPPH自由基清除率的影響,確定最佳酶底比0.25%;底物濃度對各指標影響均不顯著,從高效利用乳清蛋白粉的角度考慮選擇3%作為最佳底物濃度值。因此,綜合以上結果,復合蛋白酶水解乳清蛋白的最佳作用條件為A1B2C1D1即,pH6.0,酶解溫度50 ℃,酶底比0.25%,底物濃度3 g/100 mL。在確定的最佳作用條件下,進行3次重復驗證實驗,得到乳清蛋白的水解度為28.47%±0.59%、DPPH自由基清除率為91.42%±0.51%、羥基自由基清除率為80.85%±0.47%、總抗氧化能力為46±0.65 μmol/L,分別與正交試驗第2組的結果(29.75%±0.27%、94.67%±0.84%、81.47%±0.44%、48±0.69 μmol/L)相近,表明驗證實驗結果與正交試驗結果相符,進一步驗證了本研究確定的酶解條件為最佳條件。

表7 正交試驗結果的方差分析Table 7 Analysis of variance of the results of orthogonal array design

2.6 復配乳清蛋白酶水解前后分子量分布分析

酶解法制備抗氧化肽的反應條件溫和、快速、可控、安全性較高,已是制備抗氧化肽的主流方法[26]。肽的抗氧化活性與序列中的氨基酸組成、氨基酸排列順序、分子量大小、肽鍵及肽的空間結構有關[27]。通常認為具有供氫或供電子能力的氨基酸殘基如Tyr、Trp、Cys、Met及His等具有清除自由基的能力,疏水性的氨基酸殘基能夠增強肽抑制脂質過氧化的能力,而酸性及堿性的氨基酸殘基具有螯合金屬離子的能力[28]。合適的肽鏈長度能增強抗氧化肽與自由基的相互作用,從而阻斷脂質過氧化鏈式反應[29]。低分子量的小肽不但具有較高的轉運吸收速率,還具有較強的抗氧化活性。分子量1000 Da以下的多為二肽、三肽和四肽。本實驗在最佳酶解條件下得到的WPPH分子量分析結果表明:乳清蛋白粉經過復合酶水解后低分子量肽段明顯增多,其中分子量低于1000 Da的肽段占比>50%(圖7)。推測WPPH的抗氧化活性可能與其分子構效相關,后期需對其進一步研究。

圖7 復配乳清蛋白酶水解前后分子量分布分析結果Fig.7 Result of molecular weight distribution analysis before and after hydrolysis of whey proteinase

3 結論

本研究以乳清蛋白粉為原料,以其WPPH的抗氧活性為評價指標,通過單因素及L9(34)正交實驗,確定了乳清蛋白粉的以胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶進行雙蛋白酶復配的最佳酶解條件為pH6.0,酶解溫度50 ℃,酶底比0.25%,底物濃度3 g/100 mL,在此條件下WPPH水解度達到34.24%,分子量低于1000 Da的肽段占比在50%以上,DPPH自由基清除率91.42%±0.51%、羥自由基清除率80.85%±0.47%、總抗氧化能力(46±0.65) μmol/L,制備得到的WPPH具有較強的抗氧化活性,為高抗氧化性乳清蛋白粉的高效制備及應用提供了研究基礎。