百香果果皮多糖提取工藝優化及其抗氧化活性研究

帥 良,廖玲燕,段振華,宋慕波,梁園麗,謝玉花,劉云芬

(賀州學院,食品與生物工程學院/食品科學與工程技術研究院,廣西賀州 542899)

百香果(PassifloraeduliaSims)是西番蓮科西番蓮屬的草質藤本植物,廣泛種植于熱帶亞熱帶地區,是我國主要的熱帶水果之一[1-2]。百香果是典型的藥食同源的高品質水果,具有很高的食用價值和藥用價值。目前百香果主要用作鮮食,其余用來生產果汁,而果皮則被作為廢棄物處理。實際上,百香果果皮約占鮮果重50%～55%,有研究表明,百香果果皮中含有豐富的碳水化合物、多糖、黃酮及酚類物質,特別是果膠和粗纖維含量較高[3-4],因此有必要對百香果果皮進行進一步加工利用。

多糖廣泛存在于植物、動物和微生物中,具有多種藥理活性[5],例如抗氧化衰老[6]、抗腫瘤[7]、增強免疫力[8]等。提取植物多糖的方法很多:熱水浸提法[9-10]、稀酸提取法[11]、微波提取法[12-13]、超高壓提取法[14]、亞臨界提取法[15]等。這些方法有的成本低,操作簡便,但效率很低;有的需要嚴格控制試劑用量,有的則對設備要求高,而超聲波提取法[16]可以有效縮短提取時間,排除其他溶劑的干擾,增大提取效率,原因可能是超聲波可以產生熱效應和機械剪切效應,加速物質在溶劑中的擴散溶解,空化效應可以破壞細胞結構,加速多糖的溶解,且超聲波還能產生其他次級效應,如熱效應、乳化效應、凝聚效應以及化學效應等[17]。近年來,采用超聲波提取方法已經從多種生物中提取出了多糖,如紫蘇葉[18]、毛木耳[19]、口蘑[20]等。

百香果果皮多糖的傳統提取方法有微波提取[2]、熱水浸提法[21],也有用超聲波提取百香果果膠的報道[22],但利用超聲波提取百香果果皮多糖的工藝及多糖體外抗氧化活性的研究報道較少。

本研究采用超聲波法提取百香果果皮多糖,通過進行液料比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度4個單因素試驗來確定影響多糖得率的主要因素,采用響應面法優化提取工藝,并對多糖的體外抗氧化活性進行分析,為百香果果皮的進一步利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫百香果 購買于廣西壯族自治區賀州市水果批發市場,本研究取其干燥果皮作為供試材料;三氯甲烷 分析純,廣東省精細化學品工程技術研究中心;苯酚、抗壞血酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵 分析純,成都市科龍化工試劑廠;硫酸、水楊酸 分析純,西隴科學股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 色譜純,上海藍季科技發展有限公司;鐵氰化鉀 分析純,汕頭市光華化學廠;磷酸二氫鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;活性炭、正丁醇、過氧化氫、磷酸氫二鈉、無水乙醇 分析純,廣東省化學試劑工程技術研究開發中心;三氯乙酸、無水葡萄糖 分析純,天津市大茂化學試劑廠。

KQ3200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;KDC-40低速離心機 安徽中佳科學儀器有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;FA2004B電子天平 上海精科天美科學儀器有限公司;HH-8數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市環宇科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波輔助法提取果皮多糖 提取方法參考張麗紅[18]和黎云龍等[23],略有修改。稱取1 g百香果干燥果皮粉末于50 mL錐形瓶中,按照一定液料比加水,在一定超聲功率和超聲溫度下,超聲一定時間,抽濾得到粗多糖提取液。向上述提取液加入0.5 g活性炭,攪拌均勻,40 ℃恒溫水浴加熱15 min,抽濾得到多糖脫色液。Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1,mL/mL)與多糖脫色液等體積混合,用磁力攪拌器震蕩35 min,再3000 r/min 離心10 min,收集上清液即為脫色脫蛋白的多糖提取液。

1.2.2 單因素實驗設計 在超聲功率150 W、超聲時間20 min、超聲溫度60 ℃時,考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL∶g)對百香果果皮多糖得率的影響;在液料比40∶1 mL∶g、超聲時間20 min、超聲溫度60 ℃時,考察超聲功率(50、100、150、200、250 W)對百香果果皮多糖得率的影響;在液料比40∶1 mL∶g、超聲功率150 W、超聲溫度60 ℃時,考察超聲時間(15、20、25、30、35 min)對百香果果皮多糖得率的影響;在液料比40∶1 mL∶g、超聲功率150 W、超聲時間20 min時,考察超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)對百香果果皮多糖得率的影響。

1.2.3 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上,以液料比(A)、超聲功率(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)為主要影響因素,多糖得率為響應值,根據Box-Behnen試驗設計原理,按照表1進行四因素三水平的響應面分析試驗。

表1 響應面因素及水平設計Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 多糖得率的測定 多糖得率的測定采用苯酚-硫酸法[24]。稱取1 g標準葡萄糖(使用前于105 ℃烘干至恒重),用少量水溶解后定容至1 L,于4 ℃冰箱中保存。使用時稀釋4倍得250 μg/mL葡萄糖標準液。以葡萄糖質量濃度為橫坐標(μg/mL),在490 nm處測得的吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。

吸取1 mL脫色脫蛋白多糖提取液,稀釋40倍后參照標準曲線測定方法測定多糖得率,平行測定5次,并根據公式(1)計算百香果果皮多糖的得率:

式(1)

式中：x-標曲上對應濃度(mg/mL);V1-為比色測定時吸取樣液體積(1 mL);V2-為提取液總體積(mL);N-為稀釋倍數(40);m-為百香果果皮質量(g)。

1.2.5 百香果果皮多糖抗氧化活性分析

1.2.5.1 百香果果皮多糖對DPPH自由基清除能力的測定 測定方法參考蔣得旗等[25]、She等[26]的方法,略有改動。準確移取2 mL 0.2 mol/L DPPH溶液,分別加入1.2 mL不同質量濃度的多糖樣液(0、0.5、1、1.5、2 mg/mL),充分混勻后,于室溫黑暗條件下放置30 min,取上清液測定517 nm處的吸光值A2,同法測定樣液加無水乙醇的吸光值A1以及純水加DPPH溶液的吸光值A0,按照公式(2)計算百香果多糖對DPPH自由基的清除率。配制同濃度的維生素C(VC)溶液且按照上述操作步驟進行VC對DPPH自由基的清除率的測定,與百香果多糖對DPPH自由基的清除率進行對比。

式(2)

1.2.5.2 百香果果皮多糖對羥自由基的清除能力測定 測定方法參考李霞等[2]、廖玲燕等[27]的方法,略有改動。依次向具塞試管中準確移取0.5 mL 0.15 mol/L的FeSO4溶液、2 mL 2 mmol/L的水楊酸溶液、2.5 mL蒸餾水和1 mL不同質量濃度的多糖樣液(0、0.5、1、1.5、2 mg/mL),充分混勻后加入1 mL 6 mmol/L H2O2啟動反應,于37 ℃下反應1 h,取上清液在510 nm處測定吸光值A2,同法測定用水代替H2O2溶液的吸光值A1,以及用水代替樣液的吸光值A0,按照公式(3)計算百香果多糖對羥自由基的清除率。配制同濃度的VC溶液且按照上述操作步驟進行VC對羥自由基的清除率的測定,與百香果多糖對羥自由基的清除率進行對比。

式(3)

1.2.5.3 百香果果皮多糖還原力的測定 具體操作參考廖玲燕[27]等的方法,略有改動。準確移取1 mL不同質量濃度的多糖樣液(0、0.5、1、1.5、2 mg/mL),依次加入0.2 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液和0.5 mL 1%的K3Fe(CN)6,震蕩混勻,50 ℃下水浴20 min后取出,快速冷卻,加入1 mL 10%的三氯乙酸終止反應,取0.1 mL上清液加入0.2 mL1%的FeCl3和3 mL蒸餾水,充分搖勻后靜置5 min,于700 nm處測定吸光值,用吸光值表示還原力。配制同濃度的VC溶液且按照上述操作步驟進行VC的還原力測定,并與百香果多糖還原力進行對比。

1.3 數據處理

每個試驗隨機重復3次,結果以平均值±標準偏差表示,用Excel 2016軟件進行作圖,方差分析采用SPSS 19.0進行,顯著水平P<0.05,極顯著水平P<0.01。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 液料比對百香果果皮多糖得率的影響 由圖1可知,多糖得率隨著液料比的增大呈增大趨勢,原因可能是多糖屬于水溶性物質,溶劑越多,溶解多糖能力越強,在液料比達到40∶1時,得率達到最大,為5.441%;此后液料比的增大使得吸附作用增強從而導致多糖提取率略有下降[28],因此最佳提取液料比選擇40∶1 mL/g。

圖1 液料比對百香果果皮多糖得率的影響Fig.1 Effect of the liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharide from passion fruit peel

2.1.2 超聲功率對百香果多糖得率的影響 由圖2可知,當超聲功率在50～150 W時,得率呈上升趨勢,在150 W時達到最大為5.432%;此后超聲功率增大,得率略有降低,也有可能是由于超聲功率過大,導致溫度過高,多糖被氧化破壞,產生雜質,致使提取率下降[29],所以選擇提取功率為150 W。

圖2 超聲功率對百香果果皮多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharide from passion fruit peel

2.1.3 超聲時間對百香果多糖得率的影響 由圖3可知,當超聲時間在15～20 min時,多糖得率增大,20 min時達到最大值為5.484%,可能原因是隨著超聲時間的延長,對細胞膜的破壞作用增大,多糖溶解增多;此后隨著超聲時間的延長,得率維持在一個較低水平,原因可能是超聲波的空化作用和機械作用造成多糖分子的降解和破壞,使大量雜質滲出,導致提取率下降[30]。因此選擇適宜的超聲時間為20 min。

圖3 超聲時間對百香果果皮多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharide from passion fruit peel

2.1.4 超聲溫度對百香果多糖得率的影響 由圖4可知,隨著超聲溫度的上升,多糖得率呈先升后降的趨勢,在60 ℃時得率達最大值為5.405%。造成這種現象的原因可能是溫度升高,分子熱運動加快,使多糖能夠快速溶解,而溫度過高,則引起多糖的氧化分解[30]。所以最佳提取溫度為60 ℃。

圖4 超聲溫度對百香果果皮多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharide from passion fruit peel

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析 用Design-Expert 8.0軟件隨機產生BOX-Behnken設計試驗方案,對考察因素及其水平進行設計,并測得29次的試驗結果如表2所示,統計軟件對表2數據進行多元回歸擬合,獲得超聲波提取多糖提取率對自變量(液料比、超聲功率、超聲時間、超聲溫度)的二次多項回歸模型方程為Y=5.06+0.97A+0.027B+0.10C-0.033D+0.12AB-0.027AC-0.31AD-0.094BC-0.0025BD+0.054CD-0.30A2-0.0278B2-0.037C2-0.16D2。

表2 試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

由表3可以看出,此模型P<0.001,達到高度顯著水平;失擬項P=0.1190,不顯著,模型的確定系數R2=0.9667,說明模型的擬合程度良好。且由各因素一次項F值可知影響多糖得率的因素的主次順序為:液料比(A)>超聲時間(C)>超聲功率(D)>超聲溫度(B)。一次項液料比A和二次項A2對多糖得率影響達到高度顯著水平(P<0.001),交互項AD對多糖得率影響達到極顯著水平(P<0.01)二次項D2對多糖得率影響達到顯著水平(P<0.05),其他項均不顯著。

表3 響應面試驗結果的方差分析Table 3 Various analysis of response surface design

2.2.2 響應面交互作用分析 根據回歸分析結果做出體現另外兩個因素及其交互作用影響的響應面和等高線3D圖,如圖5～圖10所示。響應曲面坡度的陡峭程度表明隨著影響因素的變化,其對應響應值的變化情況,如果坡度相對平緩,表明響應值可以忍受條件的變化;如果坡度較陡,表明響應值對于處理條件的變化非常敏感;而等高線的情況可以反映出交互作用的強弱,橢圓形表示兩因素的交互作用顯著,圓形則相反[31]。

圖5 液料比和超聲溫度對多糖提取效果影響的響應面Fig.5 Response surfaces and contours for liquid-solid ratio and ultrasonic temperature effects on polysaccharide extraction

由圖5可知,響應曲面陡峭,液料比與超聲溫度的交互作用對多糖得率的影響較大,從等高線形狀可以看出液料比對多糖得率的影響較大。

由圖6可知,響應曲面陡峭,液料比與超聲時間的交互作用的作用對多糖得率的影響較大,從等高線形狀可以看出液料比對多糖得率的影響較大。

圖6 液料比和超聲時間對多糖提取效果影響的響應面Fig.6 Response surfaces and contours for liquid-solid ratio and ultrasonic time effects on polysaccharide extraction

由圖7可知,響應曲面陡峭,液料比和超聲功率的交互作用對百香果果皮多糖得率的影響顯著,從等高線形狀可以看出液料比對多糖得率的影響較大。

圖7 液料比和超聲功率對多糖提取效果影響的響應面Fig.7 Response surfaces for liquid-solid ratio and ultrasonic power effects on polysaccharide extraction

由圖8可知,響應曲面陡峭,超聲溫度和超聲時間的交互作用對百香果果皮多糖得率的影響較大,但不顯著,從等高線地形狀可知超聲時間對多糖得率的影響較大。

圖8 超聲溫度和超聲時間對多糖提取效果影響的響應面Fig.8 Response surfaces for ultrasonic temperature and ultrasonic time effects on polysaccharide extraction

由圖9可知,響應曲面陡峭,超聲溫度和超聲功率的交互作用對百香果果皮多糖得率的影響較大,但不顯著,從等高線形狀可知超聲功率對多糖得率的影響較大。

圖9 超聲溫度和超聲功率對多糖提取效果影響的響應面Fig.9 Response surfaces for ultrasonic temperature and ultrasonic power effects on polysaccharide extraction

由圖10可知,響應曲面陡峭,超聲時間和超聲功率的交互作用對百香果果皮多糖得率的影響較大,但不顯著,從等高線形狀可知超聲時間對多糖得率的影響較大。

圖10 超聲時間和超聲功率對多糖提取效果影響的響應面Fig.10 Response surfaces for ultrasonic time and ultrasonic power effects on polysaccharide extraction

2.2.3 最佳提取工藝的驗證 根據響應面模型及數據結果,分析得到超聲提取百香果果皮多糖的最佳提取工藝條件:料液比50∶1 (mL/g),超聲溫度69.98 ℃,超聲時間17.16 min,超聲功率100.01 W,預測百香果果皮多糖得率為6.09%,同時考慮到實際操作的局限性,將工藝參數修正為液料比為49∶1 (mL/g),超聲溫度為69 ℃,超聲時間為15 min,超聲功率為105 W。在此修正條件下進行3次平行驗證試驗,測得百香果果皮多糖的平均得率為5.890%,與預測結果接近,提示本響應面法得到的回歸模型有效、可靠,得到的工藝條件具有實際應用價值。

2.3 百香果果皮多糖體外抗氧化能力分析

2.3.1 百香果果皮多糖對DPPH自由基清除能力的影響 由圖11可知,隨著質量濃度的增大,百香果果皮多糖對DPPH自由基的清除能力逐漸提高,在質量濃度為2 mg/mL時,清除率為32.8%,IC50為3.149 mg/mL,清除率相對較低,可能原因是多糖純度不夠[32];而VC對DPPH的清除率在0～0.5 mg/mL的范圍內急劇增加,達到95.9%,此后維持在此水平。

圖11 百香果果皮多糖對DPPH自由基清除能力的影響Fig.11 The scavenging effect of polysaccharide from passion fruit peel on DPPH radical

2.3.2 百香果果皮多糖對羥自由基清除能力的影響 如圖12所示,隨著質量濃度的升高,果皮多糖對羥自由基的清除能力呈上升趨勢。當濃度達到2 mg/mL時,清除率為59%,IC50為1.436 mg/mL。而VC對羥自由基的清除能力在0～1.5 mg/mL的范圍內呈上升趨勢,在1.5 mg/mL時達到100%。

圖12 百香果果皮多糖對羥自由基清除能力的影響Fig.12 The scavenging effect of polysaccharide from passion fruit peel on hydroxyl radical

2.3.3 百香果果皮多糖還原能力的影響 如圖13所示,在試驗質量濃度范圍內,VC和百香果果皮多糖的還原能力隨著濃度的升高而增強。當濃度為2 mg/mL時,VC和百香果果皮多糖的吸光值分別為1.679、0.34,雖然多糖還原能力較VC弱,但也表現一定的還原能力,原因可能是多糖中含有酚類等物質,這些物質在多糖的還原性中起作用。

圖13 百香果果皮多糖還原能力Fig.13 Reducing force of polysaccharide from passion fruit peel

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上,采用響應面方法優化百香果果皮多糖的超聲提取工藝,建立多糖提取的二次多項式回歸模型。經過數據分析處理,得到影響多糖提取率的因素的主次序為:液料比(A)>超聲時間(C)>超聲功率(D)>超聲溫度(B),其中液料比影響高度顯著。綜合考慮實際條件,確定超聲波提取百香果果皮多糖的最佳提取條件為:液料比 49∶1 mL/g,超聲時間為15 min,超聲功率為105 W,超聲溫度為69 ℃,在此條件下,多糖得率為5.890%。另外體外抗氧化研究結果表明,百香果果皮多糖具有一定的抗氧化活性,在質量濃度為2 mg/mL時,對DPPH和羥自由基的清除率分別為32.8%、59%,活性呈量效依賴關系。同時,該多糖還具有較好的還原能力,在質量濃度為2 mg/mL時,果皮多糖吸光值為0.34。

超聲波輔助提取方法通過對細胞產生破壞作用,可以提高多糖的得率。利用此方法提取百香果果皮多糖,具有省時,高效的特點,但關于百香果果皮多糖結構解析及其抗氧化機理還有待進一步探討。以上研究結果為百香果果皮多糖的進一步開發生產提供了一定的理論基礎。