人工神經網絡在雞胸肉預冷清洗環節中沙門氏菌污染率的預測

肖興寧,楊 力,張建民,廖 明,李延斌,肖英平,楊 華,*,汪 雯,*

(1.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所,農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(杭州),農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室,浙江杭州 310021;2.中國計量大學信息工程學院,浙江杭州 310018;3.華南農業大學獸醫學院,廣東廣州 510642;4.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058;5.阿肯色大學生物與農業工程系,阿肯色州費耶特維爾 72701)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的人畜共患病原菌,我國每年約有3億人因沙門氏菌感染而患病[1-2]。肉雞是沙門氏菌的常見宿主,易在屠宰加工過程(淋雞、掛雞、宰殺、瀝血、浸燙、脫毛、掏膛、內腔淋洗、預冷清洗等環節)發生交叉污染[3-4]。有研究表明,肉雞屠宰預冷后沙門氏菌污染率從10%～12.5%升高至27.5～37.5%[5-6]。因此,預測屠宰預冷清洗過程中沙門氏菌污染率的變化,對保障產品安全具有重要意義。

人工神經網絡(artificial neural network,ANN)模型是一種模仿生物神經網絡進行分布式并行信息處理的數學模型[7-8]。與傳統的線性或非線性回歸方法相比,它具有以下優點:較強的學習能力;是一個多輸入多輸出的系統;是一種復雜的非線性系統;可以并行運算,具有極快的運算速度,響應時間短,可以滿足在線模擬、在線優化的需要[9-11]。Singh等[12]比較了響應面模型和人工神經網絡模型用于蠟樣芽孢桿菌MTCC 1305產生L-谷氨酰胺酶培養條件的優化效果,結果發現神經網絡模型的預測結果優于響應面模型。廣義回歸神經網絡(General Regression Neural Network,GRNN)是建立在數理統計基礎上的徑向基函數網絡,其理論基礎是非線性回歸分析[13]。陳光等[14]構建GRNN模型實現了對高爐煉鐵能耗的預測。反向傳播人工神經網絡(Back Propagation Neural Networks,BP)算法簡單,易于實現。單金卉等[10]構建了BP神經網絡用于實現油炸外裹糊魚塊的丙烯酰胺含量的預測。Cheng等[8]也構建了BP神經網絡模型用于徑流量的預測。與反向傳播人工神經網絡模型相比,廣義回歸網絡擁有更好的泛化能力,同時還具有網絡計算結果全局收斂的特性以及具有更強的非線性映射能力和學習速度[13]。此外,GRNN建模需要的樣本數量少,對于樣本數據缺乏的預測問題,采用GRNN模型能更好的滿足預測結果的精度要求[7]。

目前,雞肉沙門氏菌風險評估中鮮見用ANN模型對預冷清洗環節交叉污染沙門氏菌污染率的預測研究。課題組前期構建了響應面模型預測細菌污染率[15]。本研究建立以初始污染水平、初始污染率、NaClO濃度為輸入值,預冷后沙門氏菌污染率為輸出值的GRNN模型,預測雞胸肉預冷清洗后的沙門氏菌污染率,為優化預冷清洗工藝和雞肉沙門氏菌定量風險評估提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腦心浸液肉湯(BHI)、緩沖蛋白胨水(BPW)、木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉瓊脂(XLT4)培養基 均美國BD公司;亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC) 青島海博生物技術公司;NaClO溶液 生工生物工程(上海)股份有限公司;斯坦利沙門氏菌BYC12(S. Stanley)、印第安納沙門氏菌HZC10(S. Indiana)、鼠傷寒沙門氏菌YXC1(S. Typhimurium)、湯卜遜沙門氏菌LWC10(S. Thompson)、肯塔基沙門氏菌CBC2(S. Kentucky) 5株菌均分離于廣州某屠宰場,由華南農業大學獸醫學院提供,菌株保存于含有20%甘油的腦心浸液肉湯中,儲存于-80 ℃冰箱備用;雞胸肉 浙江省杭州市華潤萬家超市。

Thermo Fisher 1389型生物安全柜 英國Waltham;HVA-85型高壓滅菌鍋 日本Hirayama;KB240型恒溫恒濕培養箱 德國Binder;Seward 400型拍打式均質機 英國Seward公司;WASP 2型螺旋接種儀 英國Don Whitley Scientific公司;ProtoCOL3型全自動細胞計數儀 英國Synbiosi公司;CS180型百靈達余氯傳感儀 英國Palintes公司;CR400型手持式色差儀 日本ChromaMeter公司;Hitachi 7650型透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;TX150型水浴鍋 英國Grant公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備及雞肉接種 5株菌株解凍后分別接種至5 mL BHI液體培養基中,置于37 ℃恒溫培養箱中過夜培養,將菌液等體積均勻混合,制得25 mL菌種原液,約9lg CFU/mL。用BPW稀釋菌種原液,使初始接種液濃度約為7lg CFU/mL。將雞肉浸泡于接種液中30 min,轉移至無菌稱量盤,在生物安全柜內靜置30 min,確保細菌附著在雞肉表面。雞肉表面初始接種水平約為5lg CFU/g。

1.2.2 預冷清洗實驗設計及預冷清洗 將響應面試驗法(response surface methodology,RSM)與GRNN結合,既可以通過RSM的設計方法減少試驗次數,又能利用GRNN更高的預測精度,減小預測誤差。選取初始污染水平、初始污染率和NaClO濃度作為影響污染率的關鍵因素,采用響應曲面方法中的Central Composite design中心組合設計研究清洗過程中各因素的作用以及因素間的交互作用[16-18]。所有實驗因素均為5個水平(-α,-1,0,+1,+α),具體因素水平如表1所示。

表1 因素組合表Table 1 Levels of variables in the experiment

為了調查預冷清洗過程中的污染率變化,實驗前,將水浴鍋溫度調節至4 ℃,雞肉與清洗水的比例為1∶10 (w/v)。以表2第一組交叉污染清洗試驗條件為例,在水浴鍋中共放入30塊雞胸肉,對其中10塊雞肉進行人工接種(1.8lg CFU/g),其余20塊為無菌雞肉,將接種雞肉與無菌雞肉全部放入濃度為79.7 mg/L NaClO的水中清洗40 min,實驗于室溫下進行25 ℃,整個實驗重復2次。其余19組交叉污染清洗過程與第一組的操作一致。

1.2.3 污染率測定及計算 清洗后雞肉樣本轉移至含有25 mL BPW的均質袋中,以250 r/min速度拍打1 min,取1 mL均質液至9 mL SC增菌液中,37 ℃過夜培養。取10 μL增菌液涂布于XLT4瓊脂培養基中,37 ℃恒溫培養16～18 h,若平板長出黑色菌落,則判斷為沙門氏菌陽性樣本。雞肉清洗后沙門氏菌污染率(P,%)計算如公式1所示,

式(1)

式中:T為雞肉清洗后沙門氏菌陽性樣本量,S為雞肉樣本總量。

1.2.4 GRNN模型的建立及模型評價 廣義回歸神經網絡模型由4層結構組成:輸入層即為研究設定的自變量,模式層是對樣本進行訓練的隱回歸層,模式層數據由輸入層數據經高斯傳遞函數傳遞得到,模式層神經元個數與輸入層神經元個數相等,模式層神經元傳遞函數如公式2所示。求和層利用2種不同類型的神經元對模式層神經元數據求和,求和層求和方式分為直接求和(公式3)與加權求和(公式4)。最終運算得到結果傳至輸出層,輸出層將求和層結果相除得到估計結果(公式5)[14,19]。在本研究中,輸出層中有一個節點,即預冷后沙門氏菌污染率。輸入層中有三個節點,分別為初始污染水平、初始污染率、NaClO濃度,沙門氏菌污染率預測的廣義回歸神經網絡模型結構如圖1所示。

圖1 沙門氏菌污染率的廣義回歸神經網絡預測模型Fig.1 GRNN prediction model of Salmonella incidence

式(2)

式中:X為神經網絡的輸入變量;Xi為第i個神經元的學習樣本。

式(3)

式中:SD為直接求和輸出值。

式(4)

式中:SNj為加權求和輸出值。

式(5)

式中:yj為模型輸出層參數值。

相關系數r值是用于表明實際值和預測值之間的線性相關性。預測標準誤差(Standard error of prediction,SEP),如式(6)常用來評價網絡模型是否合適,SEP值越小意味著該神經網絡模型的性能越好[8,10,20-21]。平均絕對誤差(Mean absolute error,MAE)能更好的反映預測值誤差的實際情況[22-23],如式(7)。

式(6)

式(7)

GRNN模型的驗證數據集為選用雞胴體樣本進行額外的8組預冷清洗實驗(測試集中未出現的數據集),得到的細菌污染率結果用于模型驗證。

1.3 數據處理

實驗重復2次,取其平均值,結果以平均值±標準差表示。本研究采用JMP 10軟件進行Central Composite design實驗設計,并利用NeuralTools7建立GRNN模型,進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 雞胸肉預冷清洗后的細菌污染率

雞胸肉預冷后沙門氏菌的污染率如表2所示,清洗后的細菌污染率變化范圍為30.0%～91.7%。初始污染水平、初始污染率和NaClO濃度對污染率均有顯著性影響(P<0.05),其中初始污染水平對污染率的影響最為顯著(表3)。初始污染水平和初始污染率與細菌污染率呈正相關,NaClO濃度與細菌污染率呈負相關[15]。Yang等[5]研究發現添加50 mg/L的氯,可使細菌污染率下降到20%。因此預冷水中添加氯殺菌劑,可顯著降低屠宰加工過程中的沙門氏菌污染率[5,24]。然而,有研究發現當細菌對氯殺菌劑存在抗性時,未發現細菌污染率和氯濃度之間的相關關系[25]。

表2 各因素組合下的污染率實際值及GRNN模型的污染率預測結果Table 2 Actual data and predict data by GRNN for post-chill incidence under different combination of factors

表3 各因素方差分析結果Table 3 ANOVA analysis in each factor

2.2 GRNN的訓練結果

采用16組數據作為神經網絡的訓練數據集,預冷清洗后的沙門氏菌污染率實際值與預測值的相關系數為0.93(圖2),模型SEP值為10.8%,表明該GRNN模型擬合能力良好,可通過訓練數據概括出各因素影響沙門氏菌污染率的內在規律,較準確模擬雞胸肉預冷清洗中沙門氏菌污染率的變化。基于3因素5水平的中心組合響應面實驗設計被廣泛用于ANN建模中[22,26-28]。Ghosh等[22]基于該實驗設計的20組數據,構建Cu吸附的ANN模型,并選取其中的12組數據作為模型的訓練數據集。Sinha等[26]也基于3因素5水平的中心組合響應面試驗設計下的20組數據,構建了微波輔助提取紅木種子中的天然染料的ANN預測模型。由此可見,基于RSM實驗設計獲取的數據量可用在ANN模型的構建中并較好的實現預測。

圖2 GRNN模型訓練集實際值與預測值的比較Fig.2 Compare the actual values and predicted values from the training set of GRNN model

2.3 RSM與GRNN模型擬合效果比較

課題組前期構建了RSM模型預測雞胸肉預冷清洗環節的沙門氏菌污染率[15],本研究利用訓練好的GRNN模型對8組驗證數據進行預測,結果如表4所示。RSM模型和GRNN模型的r值均大于0.9、SEP值均小于35%并且MAE值均較小(表5),表明GRNN和RSM模型均可較好的預測雞胸肉預冷清洗后的沙門氏菌污染率,但ANN模型預測能力略優于RSM模型。Yang等[23]構建ANN和RSM模型優化蕓豆抗氧化劑,結果發現ANN模型的預測精確度優于RSM模型。在利用RSM和ANN模型預測羧化纖維素納米晶須修復水中銅的能力研究中也發現ANN模型的預測能力較好[27]。

表4 RSM模型與GRNN模型驗證結果Table 4 Validation for RSM and GRNN models

表5 RSM模型與GRNN模型評價結果Table 5 Model evaluation for RSM and GRNN models

3 討論與結論

RSM的設計方法可減少試驗次數,RSM模型的原理是回歸技術,在多項式類型中,多元三次方程與生物學結合的并不是很好(高次方程所繪曲線易出現波峰和波谷),因此普遍采用多元二次方程[28-29]。ANN被廣泛用于非線性多元建模,與RSM模型相比,ANN的主要優勢在于它可較好擬合大多數非線性函數。Karnik等[28]構建了ANN與RSM模型對鉆孔毛刺尺寸進行預測,結果發現ANN模型可更好的預測鉆孔毛刺尺寸。此外,當數據量較少時,ANN也可較好的實現對數據的擬合[30]。催化劑催化合成直鏈烷基苯的ANN模型構建的數據來源于RSM實驗設計下的17組數據[31]。Desai等[30]認為基于RSM的實驗數據足以建立有效的ANN模型。

本研究以初始污染水平、初始污染率、NaClO濃度為輸入層變量,雞胸肉預冷清洗環節的沙門氏菌污染率為輸出層變量構建GRNN模型,其中網絡的訓練數據集、測試數據集分別為16組、4組實驗數據。構建的GRNN模型(r=0.93,SEP=13%)和課題組前期構建的RSM模型(r=0.90,SEP=14%)均可較好的預測雞胸肉預冷清洗后的沙門氏菌污染率。RSM的設計方法可減少試驗次數,ANN可提供更高的預測精度。因此,未來可考慮基于RSM實驗設計獲取的數據來構建ANN模型用于預測。