香蕉果酒低溫發酵過程中揮發性香氣成分的變化

韋 璐,楊昌鵬,孫欽菊,黃 杰,陳智理,唐 婷

(廣西農業職業技術學院,廣西南寧 530007)

香蕉是全世界最重要的熱帶水果之一,產量居世界前四[1]。香蕉果肉營養價值頗高,含有豐富的碳水化合物、蛋白質、氨基酸、維生素和多種微量元素,它具有降血壓、抗肥胖、防憂郁,緩解胃潰瘍和肌肉痙攣、美白淡斑等多種功效[2-3]。但是香蕉是一種典型的呼吸躍變型果實,采摘后快速成熟,同時由于產地集中,采收季節相近,使得生產地香蕉滯銷嚴重,異地銷售在運輸過程中同樣易造成大量損耗[4-5],因此需要加快香蕉深加工工業化道路,提高香蕉的附加值,從而促進中國香蕉產業的發展[6]。

香蕉果酒由香蕉果汁經發酵獲得,是一種含酒精的飲料[7]。香蕉果酒入口綿軟,芳香清甜,富含鉀、鎂等礦質營養,還含有多種氨基酸與酚類物質,長期飲用適量香蕉果酒有益于身體健康,對保護心臟、預防高血壓與心腦血管疾病有一定功效[5]。香蕉果酒符合當前酒類消費所提倡的以低酒精度替代高酒精度、以果酒替代糧食酒的趨勢[8]。

溫度是影響微生物發酵的重要因素[9]。首先,溫度影響微生物的生長繁殖,適宜的低溫發酵可以有效抑制雜菌的生長,防止酒品酸敗;其次,溫度通過影響微生物的酶促反應,從而影響其代謝產物的合成,低溫發酵過程緩慢、周期長,代謝過程反應完全,有利于風味物質的形成,張惠玲[9]研究發現,酵母菌在低溫(10 ℃)時發酵平穩、周期長,酒體香味物質豐富,還可以防止雜菌的侵害;另外,低溫發酵還可以有效提高酒體的營養及活性成分,使其口感柔和、果味濃郁[8]。

易揮發香氣成分是影響果酒風味品質的重要因素,可作為果酒品質的評價指標[10-11]。當前針對香蕉產品,多數研究集中在香蕉果酒工藝研究方面,針對香蕉果酒易揮發成分及其在發酵過程中的變化規律方面僅有少數學者研究,如溫海祥等[12]研究分析發現,香蕉酒中含有38種香氣物質,主要成分為酯類和醇類。郭先霞等[13]分析三華李香蕉復合果酒的香氣成分,研究發現復合果酒中含有13種香氣成分,主要香氣組成成分為3-甲基-1-丁醇(29.30%)、己酸乙酯(16.61%)、丁酸-3-甲基丁酯(15.08%)和辛酸乙酯(14.66%)等,而針對在低溫條件下發酵生產香蕉果酒的研究尚未見報道。

因此,本文研究在低溫條件下釀制香蕉果酒,并采用頂空固相微萃取法[14](head space solid-phase microextractions,HS-SPME)結合氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技術[15-16]對香蕉果酒發酵前期(1 d)、中期(4 d)及末期(9 d)樣品中的易揮發性成分進行提取分析鑒定,研究香蕉果酒發酵過程中主要香氣成分的變化規律,旨在為香蕉果酒的品質形成提供參考,也為后期低溫發酵生產香蕉果酒的研發及產業發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉 西鄉塘市場;高活性干酵母 南寧市安琪酵母有限公司;焦亞硫酸鉀 煙臺帝伯仕自釀機有限公司;果膠酶、白砂糖 南寧東恒華道生物科技有限責任公司 食品級;氫氧化鈉 西隴科學股份有限公司 優級純。

高效液相色譜儀(LC20A) 日本島津公司;TRACE DSQ 氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯用儀、DB-WAX毛細管柱(30 m× 0.25 mm,0.25 μm) 美國Finnigan公司;固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)裝置手柄、固定搭載裝置、50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭 美國Supelco公司;MS204S電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;循環水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;WZS32手持阿貝折光儀 上海儀電物理光學儀器有限公司;3H16RI智能高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蕉果酒制備工藝流程

1.2.2 操作要點 原材料的選取:八成熟的新鮮香蕉,無褐變,無腐爛。

去皮打漿:香蕉去皮切塊,放入打漿機中打漿。

酶解:將香蕉漿放入燒杯中,添加0.03%～0.5%的果膠酶、0.03%～0.3%的葡萄糖淀粉酶、0.03%～0.5%的纖維素酶組成的混合酶,用保鮮膜封口,置于恒溫為60 ℃的水浴鍋中酶解2～5 h。

過濾:將酶解液經離心機離心,過濾得到香蕉汁。

接種:加入0.03%的酵母,酵母在加之前要先經過活化。

調配:香蕉汁中加入適量白砂糖使其質量分數達22%[17]。

低溫發酵:將發酵液置于20 ℃培養箱,靜置發酵。

1.2.3 果酒香氣成分HS-SPEM-GC-MS分析 樣品制備:取5 mL樣品置于20 mL頂空瓶中,加入15 μL 50 μg/mL的2-辛醇作內標,將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分,于50 ℃吸附30 min,隨后將吸附后的萃取頭取出,插入氣相色譜進樣口,于250 ℃解吸3 min,同時啟動儀器進行GC-MS分析采集數據。

GC條件:毛細管柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm,0.25 μm),程序升溫,起始溫度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升至90 ℃,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持7 min,進樣口溫度250 ℃。載氣流量0.8 mL/min,為恒定流量模式[12]。

MS條件:電離方式為EI源;離子源溫度200 ℃;接口溫度250 ℃;電離能量70 eV;發射電流120 μA;檢測器電壓1.0 kV,質量掃描范圍33～400 amu;標準譜庫為NIST2.0[13]。

1.3 數據處理

實驗所得數據采用Origin 9.1軟件進行數據處理及繪圖,采用Adobe Illustrator CS5軟件進行數據圖表的修飾。

2 結果與分析

2.1 香蕉果酒發酵過程中主要香氣成分組成分析

采用HS-SPEM-GC-MS技術分析鑒定香蕉果酒低溫發酵過程中前期(1 d)、中期(4 d)及末期(9 d)發酵樣品的香氣成分組成,實驗結果表明(表1、表2),三個樣品的主要香氣成分均為酯類、醇類,占據揮發性成分的60%以上。發酵前期,香蕉果酒中檢測到57種揮發性成分,其中酯類29種,占比42.731%;醇類9種,占比22.325%;酸類3種,占比0.654%;羰基類5種,占比3.434%;烷烴類9種,占比7.317%;酚類2種,占比0.608%。發酵中期,香蕉果酒的香氣成分中除醇類物質占比略微下降之外,其他物質含量均呈上升趨勢,此時果酒中檢測到62種香氣成分,其中酯類27種,占比48.712%;醇類8種,占比20.941%;酸類5種,占比3.342%;羰基類6種,占比4.685%;烷烴類13種,占比9.444%;酚類3種,占比0.703%。發酵到達終點時,香蕉果酒中醇類物質含量明顯增加,羰基類和烷烴類含量呈下降趨勢,而酸類和酚類物質變化則不明顯,此時果酒共檢測到51種香氣成分,其中酯類27種,占比35.74%;醇類7種,占比31.576%;酸類6種,占比3.155%;羰基類3種,占比1.209%;烷烴類6種,占比5.388%;酚類2種,占比0.705%。

表1 香蕉果酒發酵過程中香氣成分GC-MS的分析結果Table 1 Analysis results of aroma components in banana wine by GC-MS during the fermentation

續表

續表

表2 復合果酒發酵過程中第1、4、9 d中各香味成分種類數量Table 2 Numbers of aroma components on days 1,4 and 9 of compound fruit wine in fermentation process

圖1 香蕉果酒發酵過程中各階段樣品香氣成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components in various stages of Banana wine fermentation by GC-MSA:發酵前期(1 d);B:發酵中期(4 d);C:發酵末期(9 d)。

因此,在香蕉果酒低溫發酵期間,香氣成分總相對含量呈先上升后下降,之后趨于平穩的狀態。其中醇類、酸類和酚類物質含量逐漸增加,而酯類、羰基類和烷烴類占比先增加后減少,總體呈下降趨勢(圖2)。

圖2 香蕉果酒發酵過程中各階段樣品香氣成分的相對含量Fig.2 Content of aroma components in various stages of Banana wine fermentation

2.2 香蕉果酒發酵過程中主要香氣成分種類分析

2.2.1 發酵過程中酯類物質變化分析 酯類物質在果酒香氣呈現中起重要作用,可作為評價果酒的重要指標[18],其來源可能有以下幾條途徑:一是直接來源于香蕉;二是通過酯化反應獲得;三是酵母菌活動的產物。由于發酵末期酵母菌活動較弱,因此與發酵中期相比,末期香蕉果酒中酯類物質有所下降。其中乙酸乙酯、乙酸異丁酯、異戊酸丁酯、2-乙基己基乙酸酯、己酸異戊酯、醋酸辛酯、壬酸乙酯、月桂酸甲酯、1-甲基乙基-2-甲基丙酸酯、癸酸異戊酯僅存在于發酵前期,發酵中期和末期香蕉果酒中均未檢測到,而在發酵末期香蕉果酒中檢測到的乳酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、順式-2-丁烯酸乙酯、4-己烯羧酸甲酯、異丁酸戊酯、順式-4-辛烯酸乙酯、乙酸環己基乙酯、γ-丁內酯、4-羥基丁酸乙酯,在發酵前期和中期香蕉果酒中均未發現。

酯類大多具有花香和果香等特性,圖3為香蕉果酒相對含量較高的幾種酯類成分,選取其中研究較多且香氣較為突出的成分進行詳細分析:如辛酸乙酯(12.165%)含量最高,具有玫瑰花香和橙果香,賦予果酒白蘭地香型香氣[19];其次是癸酸乙酯(8.114%),賦予香蕉果酒似葡萄的果香及椰子香型香氣,是葡萄酒香氣的重要成分[20];己酸乙酯(3.168%),賦予香蕉果酒草莓香味、茴香味和青蘋果香味[18];乙酸苯乙酯(2.597%)具有玫瑰花香、類似蘋果樣的果香和蜂蜜樣的甜香;異戊酸丁酯呈香蕉香氣和藍干酪香味;辛酸甲酯(0.212%)呈水果、甜橙香氣;另外,一些低含量的香氣成分同樣能輔助提升香蕉果酒的整體品質,如乙酸乙酯具有強烈的似梨果香及菠蘿香味[21-22];丁酸異丁酯(0.042%)具有似蘋果和菠蘿樣香氣,還有朗姆酒樣的甜味;丁酸異戊酯具有強烈的香蕉、洋梨芳香氣味;月桂酸乙酯(0.024%)具有油脂、稍帶葉樣和似花瓣的溫和香氣;十四酸乙酯呈椰子和鳶尾油香氣,并帶有油脂氣息[23]。

圖3 香蕉果酒發酵過程中各階段樣品酯類物質的相對含量變化Fig.3 Relative content changes of esters substancesin various stages of Banana wine fermentation

酯類物質在香蕉果酒揮發性香氣成分中占比最大,種類最多,對果酒的香氣品質有重要作用,是影響香蕉果酒香型的主要因素[24]。李凱等[25]研究發現紅心火龍果酒中共檢測到118種香氣成分,其中酯類物質含量最高,對酒體的香型貢獻最大,其次是醇類及酸類,賦予果酒水果香及花香,還有少量醛類、烯烴類及酚類物質輔助果酒香氣的形成,這與本文香蕉果酒的研究結果相一致。

2.2.2 發酵過程中醇類物質變化分析 圖4為香蕉果酒相對含量較高的幾種醇類成分在發酵過程中的變化情況,醇類是果酒的主要呈味物質,在果酒口感及香型的形成方面發揮重要作用。醇類物質來源可能有兩條途徑:一是糖分解代謝的產物,二是通過氨基酸Ehrlich途徑轉化獲得,是果酒香氣中的主要成分[26],相對含量僅次于酯類。醇類物質在香蕉果酒低溫發酵過程中增加顯著,本文選取幾種常見成分進行詳細分析,其中尤其乙醇(19.447%)相對含量增加最為明顯,由前期的10.491%增加至末期的19.447%,是酒精發酵階段的主產物,香氣柔和、甜潤,可以輔助果酒呈香;其次是異戊醇(9.656%),賦予果酒成熟的果香和草香味[27],在整個發酵過程中呈現先下降后上升的趨勢,前期和末期的含量相差不大;發酵末期異丁醇的含量高于前期和中期;而正己醇和2-戊醇含量相對較小,發酵過程中變化不明顯。此外,正戊醇、順式-3-辛烯-1-醇和1-辛炔-3-醇僅在發酵前期檢測到,2-十二烷醇和3,3-二甲基-2-戊醇則是在發酵后期形成的,這些醇類物質賦予果酒馥郁、醇厚的味道和口感。

圖4 香蕉果酒發酵過程中各階段樣品醇類物質的相對含量變化Fig.4 Relative content changes of alcoholic substancesin various stages of Banana wine fermentation

2.2.3 發酵過程中酸類物質變化分析 圖5為香蕉果酒相對含量較高的幾種酸類成分在發酵過程中的變化情況,酸類物質是酵母的次級代謝產物,同時也作為酯類合成的前體物質[28-29]。香蕉果酒低溫發酵過程中,酸類物質的種類及含量呈上升趨勢,本文選取對果酒香氣貢獻較大的幾種成分進行詳細分析,其中辛酸(1.69%)相對含量最高,相對含量先增加后減少,但末期含量仍高于前期,具有奶酪味和水果香氣;其次為乙酸(0.336%)總體呈上升趨勢,具有濃郁的醋香味;正癸酸是在發酵中期時產生的,發酵末期有些許下降;正己酸(0.44%)和乙酰丙酸僅在發酵末期存在,正己酸具有類似于干奶酪的氣味,這些酸類物質一般具有強烈的刺激性口感,對香蕉果酒的口感影響較大,低濃度時具有清新、使人愉快的香味,對果酒的口感及滋味有較好的修飾作用,若濃度過高則會對酒體的香味和品質造成負面影響[18,30]。

圖5 香蕉果酒發酵過程中各階段樣品酸類物質的相對含量變化Fig.5 Relative content changes of acids substancesin various stages of Banana wine fermentation

2.2.4 發酵過程中羰基類物質變化分析 圖6為香蕉果酒相對含量較高的幾種羰基類成分在發酵過程中的變化情況,羰基類物質主要包括醛類和酮類,它們多數是由微生物代謝產生的[31]。香蕉果酒中羰基類物質含量雖然不高,但這些物質獨有的香氣特征對香蕉果酒的呈香有較好的輔助作用。本文選取目前研究較多的幾種香氣成分進行著重分析,其中2-戊酮和2-庚酮,在發酵過程中含量逐漸減少,后者具有似梨的水果香味;壬醛(0.081%),在發酵中期時產生,到發酵末期明顯下降,具有玫瑰、柑橘等香氣[32];除此之外,還有異戊醛具有令人愉快的水果香氣[33];癸醛具有甜香、柑橘香、蠟香及花香;十二醛具有濃郁的脂肪香氣,并有類似松葉油和橙油的香氣;3-羥基-2-丁酮稀釋后具有奶香味、香甜的焦糖氣味及果甜味[18];2,3-戊二酮具有奶油、焦糖香氣;十一醛具水果香和甜橙玫瑰樣花香。這些羰基類物質與其他香氣成分協同作用,共同形成香蕉果酒濃郁、飽滿的香型。

圖6 香蕉果酒發酵過程中各階段樣品羰基類物質的相對含量變化Fig.6 Relative content changes of carbonyls substancesin various stages of Banana wine fermentation

2.2.5 發酵過程中烷烴類和酚類物質變化分析 除了酯類、醇類、酸類及羰基類物質外,香蕉果酒中還有烷烴類及酚類物質存在,圖7、圖8分別為香蕉果酒相對含量較高的幾種烷烴類、酚類成分在發酵過程中的變化情況,在整個果酒發酵階段,其相對含量和種類均呈現先增加后減少的趨勢,烷烴類物質含量僅次于酯類和醇類,選取當前學者研究較多的幾種成分著重分析,其中S-(-)-檸檬烯在發酵中期含量最高,末期明顯減少,它僅在香蕉果酒中存在,具有檸檬味;γ-松油烯含量呈上升趨勢,但發酵末期含量降為0;2-丁烯總體也呈上升趨勢,發酵中期含量為0;十一烷和苯乙烯含量較低,前者先增加后減少,后者僅在發酵前期檢測到。另外,酚類物質在總的揮發性香氣物質中占比最小,其中2,4-二叔丁基苯酚含量最多,發酵過程中含量逐漸增加;其次為丁香酚,總體呈下降趨勢,具有濃郁的丁香香氣和溫和的辛香香氣;而4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚僅在發酵中期存在,這些烷烴類和酚類物質雖然含量相對較少,但具有明顯的香氣特征,對香蕉果酒的主體香氣有較好的修飾作用。

圖7 香蕉果酒發酵過程中各階段樣品烷烴類物質的相對含量變化Fig.7 Relative content changes of alkanes substancesin various stages of Banana wine fermentation

圖8 香蕉果酒發酵過程中各階段樣品酚類物質的相對含量變化Fig.8 Relative content changes of phenols substancesin various stages of Banana wine fermentation

除了酯類、醇類、酸類及羰基類物質外,香蕉果酒中還有烷烴類及酚類物質存在,圖7、圖8分別為香蕉果酒相對含量較高的幾種烷烴類、酚類成分在發酵過程中的變化情況,在整個果酒發酵階段,其相對含量和種類均呈現先增加后減少的趨勢,烷烴類物質含量僅次于酯類和醇類,選取當前學者研究較多的幾種成分著重分析,其中S-(-)-檸檬烯在發酵中期含量最高,末期明顯減少,它僅在香蕉果酒中存在,具有檸檬味;γ-松油烯含量呈上升趨勢,但發酵末期含量降為0;2-丁烯總體也呈上升趨勢,發酵中期含量為0;十一烷和苯乙烯含量較低,前者先增加后減少,后者僅在發酵前期檢測到。另外,酚類物質在總的揮發性香氣物質中占比最小,其中2,4-二叔丁基苯酚含量最多,發酵過程中含量逐漸增加;其次為丁香酚,總體呈下降趨勢,具有濃郁的丁香香氣和溫和的辛香香氣;而4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚僅在發酵中期存在,這些烷烴類和酚類物質雖然含量相對較少,但具有明顯的香氣特征,對香蕉果酒的主體香氣有較好的修飾作用。

3 結論

本文采用HS-SPEM-GC-MS技術對香蕉果酒低溫發酵過程中前期、中期及末期香蕉果酒的香氣成分進行分析,研究了香蕉果酒發酵過程中主要香氣成分的變化規律。研究結果表明:在香蕉果酒低溫發酵期間,香氣成分總相對含量呈先上升后下降,之后趨于平穩的狀態,其中醇類、酸類和酚類物質含量逐漸增加,而酯類、羰基類和烷烴類占比先增加后減少,總體呈下降趨勢,同樣香氣成分的種類先增加后減少,由前期的57種到末期的51種。果酒發酵前期主要香氣成分為:辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、山梨酸乙酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、乙醇、異戊醇、2-戊酮及S-(-)檸檬烯;發酵中期為:辛酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、山梨酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸異戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、乙醇、異戊醇、辛酸、2-戊酮、壬醛、癸醛、S-(-)檸檬烯及γ-松油烯;發酵后期為辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙醇、異戊醇、異丁醇、辛酸、2-戊酮、2-丁烯,這些揮發性成分共同形成了香蕉果酒的獨特風味品質。該研究對香蕉果酒風味物質的構成及發酵過程中主要香氣成分的變化規律有了初步了解,為香蕉果酒品質形成了提供參考,也為后期低溫發酵生產香蕉果酒的工業化發展提供了理論依據。