紅肉與白肉火龍果酚酸組成及其抗氧化活性

裴少培,郜海燕,房祥軍,劉瑞玲,王紹金,吳偉杰,陳杭君

(1.西北農(nóng)林科技大學機械與電子工程學院,陜西楊凌 712100;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室,中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室,浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310021)

火龍果(Hylocereusundatus)又名仙蜜果、吉祥果、紅龍果,屬仙人掌科量天尺屬和蛇鞭柱屬植物,屬典型的熱帶植物[1],因其外表肉質鱗片似蛟龍外鱗而得名。原產(chǎn)于巴西、墨西哥等中美洲熱帶沙漠地區(qū),現(xiàn)已廣泛分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)[2]。火龍果中富含糖、有機酸、氨基酸、維生素、礦質元素以及豐富的天然紅色素[3];果皮中亦含有甜菜紅素和花青素等活性物質,近年來逐漸受到人們的廣泛關注,具有良好的開發(fā)利用價值[4-5]。酚酸作為植物次生代謝產(chǎn)物廣泛存在于植物中[6-7],是植物中的一種酚類物質,大約占植物中酚類物質的1/3,主要包括香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、香草酸和原兒茶酸等,具有良好的保健功效[8-10]。植物中的酚酸是以游離、游離的酯和共軛(結合)形式存在于果蔬中[11-12]。其中游離酚酸和游離的酯酚酸屬于可溶酚酸,共軛型酚酸屬于束縛酚酸,通常以酯鍵、醚鍵與許多化合物連接[13]。此外,游離酚酸可直接通過甲醇、乙醇或者丙酮從植物中提取;游離酯和共軛酚酸可通過酸或堿水解提取[14]。

目前,檢測植物中酚酸類化合物的主要方法有毛細管電泳法[15]、氣相色譜法[16]和分光光度計法[17]等,但由于各自的局限性,都不是檢測酚酸類化合物的最佳方法[18],而高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)因其便捷性、精確性以及高度重現(xiàn)性,且可以區(qū)分結構類似的單一酚酸類化合物,成為目前國內外分析植物中酚酸類化合物的常用分析技術[19],果實中關于酚酸的種類含量變化已有諸多文獻報道:匡鳳元等[18]利用HPLC測定了蓮霧果實木質素代謝途徑中5種酚酸的含量變化,Jiao等[20]和Silvano等[21]通過HPLC分別測定了獼猴桃和荔枝中酚酸的種類和含量。另外,楊梅中富含阿魏酸、香豆酸、對羥基苯甲酸等,其中沒食子酸和原兒茶酸是主要成分[22];藍莓中的主要酚酸種類是綠原酸、阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸[23];黑莓中是主要的酚酸種類為鞣花酸[24];檸檬中主要酚酸種類是香草酸和原兒茶酸[25]。然而國內外研究中,利用HPLC對火龍果中酚酸類化合物種類與含量的分析尚未見報道。

本研究將火龍果中酚酸分為游離型(FPA)、可溶共價結合型(HPA)和束縛型(BPA)三種類型,采用HPLC法測定紅肉和白肉火龍果果皮與果肉中酚酸的主要種類和含量,并初步探討了火龍果中酚酸組成與抗氧化能力之間的關系,為火龍果中酚酸資源的開發(fā)應用提供良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅肉火龍果、白肉火龍果 采自浙江省江山市秋實家庭農(nóng)場;綠原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)、香豆酸(coumanic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、沒食子酸(gallic acid)、原兒茶酸(protocatechuic acid)、對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)、香草酸(vanillic acid)(純度均大于95%)標準樣品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(色譜純) 美國泰迪亞公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國Sigma公司;無水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、乙酸以及其他試劑 均為分析純,上海凌峰化學試劑有限公司。

Waters e2695分析型高效液相色譜儀(配有自動進樣器、二極管陣列紫外檢測器) 美國Waters公司;RE-52AA 型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;Avanti J-E高速冷凍離心機 美國Beckman公司;DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FE20實驗室pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 挑選無病害、大小均一完整的紅肉與白肉火龍果,將其清洗、瀝干表面水分后分離果皮與果肉,分別于液氮中凍干粉碎成粉末,并置于-40 ℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標準曲線繪制 配制一定質量濃度的8種酚酸標準樣品,經(jīng)混合后分別配制成終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μg/mL的混合標準液,通過HPLC按上述色譜條件進行測定。以測定得到的峰面積為縱坐標、標準樣品的質量濃度為橫坐標,繪制8種酚酸樣品的標準曲線。

1.2.3 HPLC色譜條件與檢測條件 色譜條件:迪馬C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.)。柱溫40 ℃,流動相A為4%乙酸,流動相B為甲醇,等度洗脫(A∶B=20∶80，V/V),流速1 mL/min,樣品洗脫時間35 min,每次進樣結束后用100%甲醇沖洗色譜柱20 min,平衡后再進樣。

檢測條件:上述酚酸提取液樣品進樣前均通過0.45 μm微孔濾膜過濾,每次進樣量為10 μL。綠原酸、咖啡酸、香豆酸和阿魏酸檢測波長為320 nm,沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸和香草酸的檢測波長為260 nm。PDA檢測器掃描范圍210～400 nm,外標法定量。

1.2.4 酚酸的提取

1.2.4.1 游離型酚酸提取方法 提取方法參考文獻[8],稍作修改。確稱取2.0 g火龍果凍干樣品,常溫下經(jīng)40 mL 80%乙醇超聲提取30 min,4000 r/min離心10 min后分離上清液,收集上清液后在40 ℃下旋蒸濃縮至10 mL;用6 mol/L鹽酸調pH至1～2,加10 mL乙酸乙酯和乙醚混合液(V∶V=1∶1)提取3次,合并有機相在40 ℃下旋轉蒸發(fā)濃縮至干,用5 mL無水乙醇復溶,重復3次,所得部分為FPA。沉淀部分于60 ℃下真空干燥后備用。

1.2.4.2 可溶共價結合型酚酸提取方法 參考文獻[26-27],收集1.2.4.1中萃取后的水相部分,用2 mol/L的NaOH溶液調至pH7,經(jīng)5 mL 2 mol/L的NaOH溶液堿解4 h,用6 mol/L的鹽酸調pH1～2,加10 mL乙酸乙酯與乙醚混合液(V∶V=1∶1)萃取3次,合并有機相部分在40 ℃下旋轉蒸發(fā)濃縮至干,用5 mL無水乙醇復溶,得到堿解可溶共價結合型酚酸(BHPA);余下水相部分用5 mL 6 mol/L的HCl溶液在100 ℃下水浴酸解30 min,冷卻至室溫后加10 mL乙酸乙酯乙醚混合液(V∶V=1∶1)萃取3次,收集有機相部分在40 ℃下旋轉蒸發(fā)濃縮至干,用5 mL無水乙醇復溶,所得為酸解可溶共價結合型酚酸(AHPA)。

1.2.4.3 束縛型酚酸提取方法 參考文獻[26-27],收集1.2.4.1中真空干燥后濾渣,用5 mL 2 mol/L的NaOH溶液堿解15 h,于室溫條件下4000 r/min離心15 min,收集上清液后調pH1～2,加5 mL乙酸乙酯乙醚混合液(V∶V=1∶1)萃取3次,有機相部分40 ℃下旋轉蒸發(fā)濃縮至干,用5 mL無水乙醇復溶,得到堿解束縛型酚酸(BBPA)。堿解后殘渣用5 mL 6 mol/L的HCl溶液于100 ℃下水浴酸解1 h,冷卻至室溫后于4000 r/min離心15 min,收集上清液后加10 mL 乙酸乙酯和乙醚混合液(V∶V=1∶1)萃取3次,分離有機相在40 ℃下旋轉蒸發(fā)濃縮至干,用5 mL無水乙醇復溶,得到酸解束縛型酚酸(ABPA)。

1.2.5 抗氧化能力的測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 參考李欣等[28]的方法,稍作修改。取1 mL火龍果酚酸提取液,分別加入3 mL 0.04 mg/mL的DPPH溶液,混勻后室溫下避光反應30 min,于517 nm下測定其吸光度值,空白組以1 mL無水乙醇代替。以Trolox(水溶性維生素E)溶液作為標準品制作Trolox DPPH自由基清除能力標準曲線。酚酸提取液清除DPPH自由基的能力以Trolox當量抗氧化能力(trolox equivalent antioxidant capacity,TEAC)表示,單位mg/L。

1.2.5.2 還原能力的測定 采用高鐵鹽-鐵氰化鉀比色法測定樣品的還原能力[28]。取l mL樣品溶液,加入2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖溶液和2.5 mL K3Fe(CN)6溶液(質量分數(shù)1%),混勻后50 ℃下靜置20 min,隨后再加入2.5 mL三氯乙酸溶液(質量分數(shù)10%),混合后4 ℃離心10 min(3000 r/min)。取上清液2.5 mL,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL FeCl3溶液(w/w，0.1%),充分混合后,室溫下靜置10 min,于700 nm波長處測定其吸光度。VC作為陽性對照。

1.2.5.3 羥自由基抑制能力的測定 采用羥自由基測定試劑盒測定。取0.2 mL稀釋一定倍數(shù)的酚酸提取液,加入試劑液和顯色劑后混勻,室溫放置20 min后,波長550 nm,雙蒸水調零,分別測定空白管、標椎管、對照管和測定管的吸光度值,重復三次。反應體系中H2O2濃度降低1 mmol/L為一個抑制羥自由基能力單位。

抑制羥自由基能力的計算公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定重復3次,測定結果以平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行繪圖,用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行均方差分析(one-way ANOVA)和Turkey多重比較法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(α<0.05)。用皮爾森系數(shù)分析相關性,當P<0.05時表示差異顯著,當P<0.01時表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 色譜條件確定和標椎曲線繪制

將標準樣品按照一定質量濃度溶于乙醇中,進行高效液相色譜檢測,繪制出8種酚酸標準樣品的混合標樣,確定其保留時間以及分離效果。所繪制標準樣品的液相色譜圖如圖1所示。8種標準樣品按一定稀釋倍數(shù)稀釋,繪制標準曲線,所得標準曲線的回歸方程、決定系數(shù)以及樣品的保留時間列于表1中。由表1可見,8種酚酸標準品濃度和相應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系,所得標準曲線的決定系數(shù)(R2)均≥0.998,表明此方法靈敏度較好。

圖1 8種酚酸標準樣品的液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of 8 PAs standards注:1:綠原酸;2:咖啡酸;3:香草酸;4:阿魏酸;5:沒食子酸;6:原兒茶酸;7:對羥基苯甲酸;8:香草酸。

表1 8種標準樣品的回歸方程、決定系數(shù)及保留時間Table 1 Linear concentration ranges,correlation coefficients and retained time of 8 PAs

2.2 火龍果中游離型酚酸含量

由表2可知,在FPA中,紅肉火龍果檢測出沒食子酸、對羥基苯甲和微量的原兒茶酸三種酚酸,白肉火龍果檢測出綠原酸、咖啡酸、沒食子酸和香草酸四種酚酸。其中沒食子酸在兩種火龍果的皮肉中均有分布,含量在3.00～14.70 μg/g干重;咖啡酸僅存在于白肉火龍果皮肉中,綠原酸只存在于白肉果皮中;原兒茶酸僅在紅肉果肉中檢出;對羥基苯甲酸和香草酸分別存在于紅肉果皮和白肉果皮中。香豆酸和阿魏酸在兩種火龍果皮肉中均未檢出。由此可知,紅肉火龍果中主要FPA是沒食子酸,白肉火龍果中主要FPA是咖啡酸和香草酸。

表2 火龍果中游離型酚酸含量(μg/g干重)Table 2 Contents of free PAs in pitaya(μg/g DW)

2.3 可溶共價結合型酚酸含量

由表3可知,在HPA中,綠原酸只在白肉果肉BHPA部分中檢出;香豆酸只在紅肉果肉中的AHPA部分檢出;阿魏酸和沒食子酸在兩種火龍果皮肉中均檢出;原兒茶酸在紅肉果肉以及白肉皮肉中檢測出,但是僅存在于AHPA部分;香草酸只在紅肉果皮與白肉果皮的AHPA部分存在?？Х人岷蛯αu基苯甲酸在兩種火龍果皮肉中均未檢出。

表3 火龍果中可溶共價結合型酚酸含量(μg/g干重)Table 3 Contents of soluble covalent PAs in pitaya(μg/g DW)

酚酸含量方面,阿魏酸在紅肉和白肉火龍果中均有分布,但含量較低,分別為7.10和13.60 μg/g干重。沒食子酸在紅肉果肉中的含量(1593.85 μg/g干重)顯著高于其在紅肉果皮與白肉皮肉中的含量(P<0.05);白肉果肉中的原兒茶酸(1451.55 μg/g干重)顯著高于其在白肉果皮與紅肉皮肉中的含量(P<0.05)。香草酸僅在紅肉果皮與白肉果皮中存在,且白肉果皮中的含量(817.07 μg/g干重)顯著高于紅肉果皮中的含量(P<0.05),約為紅肉果皮的5.31倍。結果表明,沒食子酸是紅肉果肉中HPA的主要成分;原兒茶酸是白肉果肉中HPA的主要成分;紅肉和白肉果皮中HPA主要成分均為香草酸。

2.4 火龍果中束縛型酚酸含量

由表4可知,綠原酸僅在紅肉果肉與白肉果肉中分布;咖啡酸和阿魏酸在紅肉皮肉與白肉皮肉中均存在,但咖啡酸僅在AHPA中檢出,阿魏酸僅在BHPA中檢出;沒食子酸僅在白肉果肉的AHPA部分檢出,含量很低(3.85 μg/g干重);原兒茶酸與香草酸均在紅肉皮肉與白肉皮肉的AHPA中檢出;而香豆酸與對羥基苯甲酸在樣品中均未檢出。

表4 火龍果中束縛型酚酸含量(μg/g干重)Table 4 Contents of bound PAs in pitaya(μg/g DW)

從總體來看,綠原酸、咖啡酸和阿魏酸雖然在兩種火龍果果皮和果肉中均有分布,但含量很低。白肉果肉中含有微量的沒食子酸;原兒茶酸和香草酸則為兩種火龍果主要的BPA;且在果皮中的含量(655.50和1084.82 μg/g干重)顯著高于果肉中的含量(128.75和133.88 μg/g干重)。

2.5 總酚酸含量的比較

總體來看,火龍果酚酸含量順序為紅肉果肉>白肉果皮>白肉果肉>紅肉果皮。由圖2可得,紅肉果肉與紅肉果皮的總酚酸(TPA)含量差異明顯,而白肉果肉與白肉果皮TPA含量差異不大。在紅肉果肉與白肉果肉中,HPA占主要部分,分別達到兩種果肉TPA含量的92.20%和89.69%;在紅肉果皮中,BPA(78.49%)占酚酸主要部分;在白肉果皮中,HPA與BPA含量無顯著差異(P>0.05),分別占TPA的49.05%和49.67%。由此可見,在果肉中,HPA是主要存在形式;在紅肉果皮中,BPA是主要存在形式;白肉果皮中,HPA和BPA是主要存在形式。另外,紅肉果皮的TPA含量為紅肉果肉的0.63倍,白肉果皮中的TPA含量為白肉果肉的1.05倍,說明火龍果皮中富含大量的酚酸資源,具有很高的潛在利用價值。

圖2 火龍果不同部位中的酚酸含量Fig.2 Comparison of PAs contents in different parts of pitaya注:FPA:游離型酚酸;HPA:可溶共價結合型酚酸;BPA:束縛型酚酸；不同小寫字母表示相同樣品不同酚酸類型數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05。

2.6 抗氧化能力

DPPH自由基的清除能力見表5,在對DPPH自由基的清除能力上不同酚酸提取液對其清除能力差異較大。整體而言,清除能力最強的是紅肉果皮中的BPA,最弱的是白肉果肉中的FPA,前者是后者的9.78倍。在FPA中,紅肉果皮的清除能力最強,是白肉果肉(最弱)的2.28倍;在HPA中,白肉果肉清除能力最強,是紅肉果皮(最弱)的1.55倍;BPA中,紅肉果皮的清除能力最強,是白肉果肉(最弱)的4.97倍。

表5 火龍果中酚酸的抗氧化能力Table 5 Antioxidant properties of different types PAs in pitaya

FPA中,紅肉果肉的還原能力最強,是VC的1.11倍;HPA中,紅肉果肉的還原能力最強,是VC的1.94倍;BPA中,白肉果皮的還原能力最強,是VC的1.31倍。造成此差異的原因可能是在HPA中,紅肉果肉的酚酸含量最高;而BPA中白肉果皮的酚酸含量最高。

FPA中白肉果皮的OH·抑制能力最強,是白肉果肉(最弱)的3.13倍;HPA中,白肉果皮抑制能力也是最強,為紅肉果肉(最弱)的2.19倍;BPA中,紅肉果皮的抑制能力最強,是白肉果皮(最弱)的6.17倍。

2.7 酚酸含量與抗氧化能力相關性分析

為進一步研究火龍果酚酸含量與其抗氧化能力之間的關系,將火龍果皮肉中不同類型的酚酸含量與DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力和羥自由基抑制能力進行Pearson相關性分析。結果如表6所示,在四種樣品中,酚酸含量與DPPH自由基清除能力和還原能力呈極顯著相關(P<0.01)。白肉果肉中酚酸含量與羥自由基抑制能力極顯著相關(P<0.01),而在其他3個樣品中,酸含量與羥自由基抑制能力之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關性。其中,在紅肉和白肉果肉中,酚酸含量與還原能力相關系數(shù)最高(P<0.01);在紅肉果皮與白肉果果肉中,酚酸含量與DPPH自由基清除能力相關系數(shù)最高(P<0.01)。DPPH自由基清除能力與還原能力在四種樣品中均具有顯著相關性(P<0.05),但羥自由基抑制能力僅在紅肉果皮中與DPPH清除能力和還原能力具有顯著相關性(P<0.05)。

表6 火龍果中酚酸含量和抗氧化能力之間相關性分析Table 6 Correlation analysis between contents of PAs and antioxidant capacities in pitaya

3 討論與結論

植物中酚酸的存在形式分為FPA、HPA和BPA三種,本文提取了紅肉火龍果和白肉火龍果中這三種類型酚酸,通過HPLC法分析其酚酸組成與含量,結果表明:果肉中酚酸含量要高于果皮,兩種火龍果中酚酸含量順序為:紅肉果肉>白肉果肉>白肉果皮>紅肉果皮。這與Kim等人研究結果不同[29],可能與處理方法和品種不同有關。兩種火龍果果肉中酚酸主要存在形式為HPA,果皮中酚酸的主要存在形式為BPA。紅肉火龍果果皮果肉中的主要酚酸是沒食子酸,其含量(1700.70 μg/g干重)顯著高于其他酚酸含量(P<0.05);白肉火龍果果皮果肉中主要酚酸是原兒茶酸,其含量(1877.50 μg/g干重)顯著高于其他酚酸的含量(P<0.05)。有研究表明[25,30],水果不同品種主要酚酸種類會不同,與本文研究結果一致。在HPA與BPA中,火龍果酸解部分的酚酸含量(4249.71和2030.24 μg/g干重)顯著(P<0.05)高于堿解部分的酚酸含量(17.92和23.40 μg/g干重),表明酸解是釋放火龍果中酚酸的主要方式,但是部分樣品在堿解時可以釋放酸解時所不能得到的酚酸,比如火龍果BPA中的阿魏酸,因此,需要根據(jù)所需酚酸種類的不同,來確定酸解與堿解的步驟[8]。另外,沒食子酸和原兒茶酸分別是紅肉和白肉火龍果中普遍存在的且普遍豐度較高、含量較高的一種酚酸,可以將其作為火龍果中抗氧化活性成分的提取分離的目標物質。

DPPH自由基清除能力、還原能力和羥自由基抑制能力可以反映酚酸提取物抗氧化能力的強弱?？寡趸芰Y果表明,兩種火龍果果肉果皮酚酸提取液均具有不同程度的抗氧化能力,其中紅肉果皮的BPA對DPPH自由基清除能力最強,紅肉果肉的HPA還原能力最強,白肉果皮HPA對羥自由基抑制能力最強,造成如此差異的原因可能與酚酸存在的種類和含量不同有關。Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn),DPPH自由基清除能力和還原能力與酚酸的含量極顯著相關(P<0.01)。高煒等[25]研究表明,不同品種檸檬的酚酸含量與DPPH自由基清除能力和還原能力呈顯著的正相關性;李欣等[28]研究發(fā)現(xiàn),丹參不同部位的抗氧化活性與其酚酸含量之間存在顯著線性相關性;也有研究表明,胡柚皮和琯溪蜜柚皮提取物的抗氧化活性可能與酚酸含量呈正相關[31-32],與本文的研究結果一致。但在本研究中,羥自由基抑制能力與酚酸含量無顯著相關性,可能是因為不同酚酸種類的結構不同,對不同體系的抗氧化作用可能不同,對不同自由基的作用存在一定的選擇性[33-34],肖默艷等[35]研究也發(fā)現(xiàn)相似的結果。有研究表明,在紅肉火龍果果肉中,黃酮類物質在抗氧化活性方面起著至關重要的作用[35],也有研究在水果中檢測到丁香酸、芥子酸、鞣花酸等其它酚酸[36],所以火龍果中游離型酚酸含量較低但卻具有較強的抗氧化能力,可能與其他抗氧化物質有關,比如類黃酮、花青素以及其他種類的酚酸等。

目前針對火龍果酚酸的研究較少,探明其在火龍果中的組成含量及其抗氧化活性對未來深入研究具有重要的意義。本研究結果表明,紅肉和白肉火龍果果肉和果皮中的酚酸種類和含量存在一定差異;具有不同程度的抗氧化能力,其中DPPH自由基清除能力和還原能力與酚酸的含量呈極顯著正相關(P<0.01),羥自由基抑制能力與酚酸含量只有在白肉果肉中呈極顯著相關(P<0.01)。本文初步探討了火龍果中酚酸的組成含量和抗氧化能力之間的關系,發(fā)現(xiàn)火龍果果肉與果皮均含有豐富的酚酸資源和優(yōu)良的抗氧化能力,為進一步開發(fā)利用火龍果中的酚酸資源提供基礎。