基于響應面法優化玉米秸稈酶降解條件研究

康 琴，葉琳洋，徐玉姍，牟 莉

(長春大學 食品科學工程學院，吉林 長春 130022)

植物纖維素資源是世界上最豐富的生物資源之一。將植物纖維素資源轉化為優質化工產品的糖是數十年來科學研究的核心，有助于解決化石能源稀缺和全球環境變化的問題[1]。在全球范圍內，植物纖維素的利用率很低。我國是一個農業大國，擁有豐富的植物纖維素資源，其中玉米秸稈高居首位。合理利用纖維素酶降解玉米秸稈，既有利于減少玉米秸稈處理不當而造成的環境污染，又能產生巨大的經濟效益[2-3]。

目前在實驗研究中使用的植物纖維素降解方法主要有三大類：物理法(微波、超聲、高溫熱解)、化學法(酸法、堿法)、生物降解法(酶法等)[4]。研究表明，在纖維素經生物酶降解的過程中，反應條件方便控制，反應過程溫和，并且沒有產生有毒污染物[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈(長春市小合隆)、市售纖維素酶(和氏璧生物工程有限公司，75 000 μ/g)、3，5-二硝基水楊酸試劑、鹽酸稀溶液、氫氧化鈉稀溶液。

還原糖標準儲備液：利用電子秤精確地稱取1 g還原糖并移至1000 mL的容量瓶中，將溶質利用一定量的蒸餾水攪拌溶解后定容至刻度，制成1 mg/mL的還原糖標準儲備液，保存備用。

還原糖標準使用液：分別取還原糖標準儲備液(1 mg/mL)20、40、60、80 mL置于100 mL容量瓶中，配制成0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的標準使用液，封存備用。

1.2 實驗儀器

PTY-A220型電子秤：華志電子科技有限公司；pH計：上海儀電科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：揚州昌哲試驗機械有限公司；掃描電鏡：日本島津。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米秸稈降解

分別稱取粉碎后的玉米秸稈1 g，倒入燒杯，加入蒸餾水50 mL，再分別加入纖維素酶，在酶解溫度、酶解時間、pH值變化的條件下進行酶降解，然后吸取1 mL酶降解液，加入DNS試劑后利用紫外分光光度計測定OD值，再代入公式計算還原糖濃度[6-8]。

1.3.2 標準工作曲線建立

分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL酶降解液于15 mL的玻璃試管中，使用移液槍添加蒸餾水,補足至1 mL后在每支玻璃試管中準確加入2 mL的DNS試劑，放置于備好的沸水中加熱，5 min后取出，利用流水冷卻。從每支玻璃試管中各取1 mL，加9 mL的去離子水，然后在540 nm波長下分別測定OD值。以測定的吸光度OD值為縱坐標、還原糖濃度(mg/mL)為橫坐標[9]，繪制實驗的標準工作曲線，見圖1。

圖1 還原糖標準曲線

1.3.3 單因素實驗

各影響因素的取值范圍：酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃；pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；酶解時間為100、110、120、130、140 min；酶用量為0.08、0.09、0.10、0.11、0.12 g。

1.3.4 響應面試驗

根據單因素實驗結果，進行響應面試驗設計[10-12]，還原糖濃度為秸稈降解效果的響應值，A代表pH值、B代表酶解時間、C代表酶解溫度、D代表酶量，將其設定為4個考察因素，確定因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 還原糖的測定

根據回歸方程：y=0.6939X+0.0022，R2=0.9969，測定還原糖濃度。

2.2 影響玉米秸稈降解的因素分析

2.2.1 優化纖維素酶的酶解溫度對降解玉米秸稈的影響

從圖2可以看出，酶解溫度對玉米秸稈降解的效果較為顯著。在溫度低于55 ℃時，隨著溫度上升，秸稈降解中還原糖濃度曲線趨向上升；當酶解溫度達到55 ℃時，還原糖濃度出現最佳值；溫度超過55 ℃后，還原糖濃度曲線開始下降，可能是由于溫度過高使纖維素酶逐漸失活。

圖2 酶解溫度對秸稈降解還原糖濃度的影響

2.2.2 優化纖維素酶的酶解pH值對降解玉米秸稈的影響

在酶解的溫度、時間等用量和酶條件保持不變時，只調整pH值，從圖3可以看出，還原糖濃度先升后降，曲線呈拋物狀，表明優化的酶解pH值對降解有較好的作用。從曲線形態來看，在pH值小于5.5的情況下，還原糖濃度逐漸上升；在pH值等于5.5時，還原糖濃度達到最高值；隨著pH值逐漸偏向中性時，還原糖濃度開始降低。因此，以酯活力為75 000 μ/g的纖維素酶降解玉米秸稈，pH值為5.5較適宜。

圖3 pH值對秸稈降解還原糖濃度的影響

2.2.3 優化纖維素酶的酶解時間對降解玉米秸稈的影響

從圖4可以看出，酶解時間對秸稈降解過程中還原糖濃度有較大影響。在酶解溫度、酶用量、酶解pH值都保持不變時，酶解時間小于120 min時，還原糖濃度逐漸增加；在酶解時間為120 min時，還原糖濃度達到最高值；當酶解時間大于120 min時, 還原糖濃度逐步下降。因此，酶解時間在120 min時，降解效果最好。

2.2.4 優化纖維素酶的添加量對降解玉米秸稈的影響

從圖5可以看出，降解過程中以纖維素酶加入量為0.1 g時出現的峰值為節點，以每0.01 g的量繼續添加，還原糖濃度隨著添加量的增加不斷上升，含量達到0.161 mg/mL。當纖維素酶的加入量達到一定值后，還原糖濃度出現逐漸降低的現象。因此，75 000 μ/g 纖維素酶降解效果以酶用量0.10 g/g秸稈為宜。

圖4 酶解時間對秸稈降解還原糖濃度的影響

圖5 酶用量對秸稈降解還原糖濃度的影響

2.3 響應面法優化試驗設計

2.3.1 響應面法優化試驗

選用Design-Expert 8.0.6 軟件設計響應面試驗[13]，以還原糖濃度為響應值Y，試驗結果見表2，方差分析見表3。將獲得的數據進行擬合分析，得到一個二次多元回歸方程。該方程可以預測給定區間內還原糖的濃度，分析得到回復方程的復相關系數R2=0.9355, 校正后的復相關系數R2=0.8562。

Y=0.16+0.001917A-0.00125B-0.00017C+0.004D-0.0005AB-0.00325AC-0.002AD+0.00025BC-0.001BD+0.0015CD-0.01541A2-0.01316B2-0.016C2-0.014D2

表2 正交試驗結果

續表2:

根據表3，試驗所得模型對玉米秸稈降解的影響較顯著(P<0.01)；試驗誤差較小，未知因素對此次試驗結果的干擾近似忽略，失擬項中P>0.05，差異不顯著；R2=0.9355，表明該模型能夠反映還原糖濃度的響應情況，擬合的情況適合該試驗，利用該模型分析還原糖濃度可行。

2.3.2 響應面工藝優化分析

選用Design-Expert 8.0.6軟件的降維分析，得到等高線圖和響應面圖，可以據此判斷各因素之間的交互作用。

圖6中的等高線呈橢圓形，響應面圖中曲面呈拋物面狀，可見酶解pH值和時間對還原糖濃度有較大的影響。當pH值一定時，秸稈與纖維素酶反應時間越長，還原糖濃度的值越大；當反應時間達到120分鐘時，拋物線出現峰值；超過120分鐘后，隨著時間增加，還原糖濃度越來越低。當反應時間保持不變時，曲面隨著pH值的加大而趨向上升；當pH值大于5.5時，曲線開始下降。綜合來看，酶解時間與pH值之間的作用對秸稈降解有顯著的影響。

表3 還原糖濃度方差分析

圖6 酶解PH值與時間對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應面圖

圖7中等高線呈明顯的橢圓形，響應面圖呈拋物狀，表示pH值及溫度在秸稈降解的過程中交互作用極為顯著。當pH值一定時，隨著溫度逐漸上升，還原糖濃度明顯提高；當溫度高于55 ℃時，拋物線開始降低；當溫度恒定、pH值為5.5時，曲線出現峰值；當pH值小于5.5時，拋物線逐漸上升；當pH值大于5.5時，拋物線開始下降。由此可見，最適溫度為56 ℃左右、最適pH值為5.5時，兩者的交互作用對秸稈降解的作用明顯。

圖8中的等高線呈橢圓形，表明酶用量與酶解pH對秸稈降解的影響顯著。當pH值一定時，酶用量在0.09～0.10 g，還原糖量隨酶用量的增加而逐漸增加，在0.1 g時達到最大值；酶用量在0.1～0.11 g，拋物線趨于平緩并下降。因此，加入適當數量的酶可以提高秸稈的降解率。當酶的添加量一定時，pH值對還原糖濃度影響呈拋物線狀。隨著溶液pH值的升高，還原糖濃度先升高后降低，在pH值為5.5左右達到最大值。

圖9中的等高線呈橢圓形，交互影響圖呈明顯的拋物狀。酶解溫度、時間對秸稈降解的作用明顯，對還原糖濃度有較大的影響。當時間一定時，隨著溫度升高，還原糖濃度逐漸提高，且還原糖濃度在55～56 ℃時達到最高值；當溫度不變時，隨著酶解時間的增加，拋物線先上升后降低。可見，溫度在降解中的作用大于時間的作用。

圖7 酶解pH值與溫度對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應面圖

圖8 酶解pH值與酶用量對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應面圖

圖9 酶解溫度與時間對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應面圖

圖10中的等高線呈較明顯的圓形，說明纖維素酶的加入量與時間之間的相互作用不強。當反應時間一定時，拋物線隨著酶用量的增加而逐漸升高；當酶的加入量超過0.1 g時，還原糖濃度出現降低趨勢。當酶的加入量不變時，還原糖濃度隨酶解時間的增加先升高后趨于穩定，在120 min時達到最高值。兩個因素對秸稈降解的相互作用不明顯。

根據圖11，等高線與交互影響的響應面圖對還原糖濃度的交互作用的顯著性較小。等高線趨于圓形，表明交互的作用小。當酶的加入量在0.09～0.1 g時，拋物線不斷上升；酶的加入量>0.1 g時，拋物線逐漸降低。當酶的添加量不變時，拋物線隨著溫度升高而上升；在55～56 ℃時，還原糖濃度出現峰值；溫度持續升高，還原糖濃度開始變小。

圖10 酶解時間與酶用量對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應面圖

圖11 酶解溫度與酶用量對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應面圖

未被降解的秸稈掃描電鏡圖 經過纖維素酶酶解的秸稈掃描電鏡圖圖12 秸稈掃描電鏡圖

2.3.3 反應前后秸稈掃描電鏡圖對比

根據圖12中的左圖，未經纖維素酶降解的玉米秸稈中的纖維素分為結晶區和無定形區。在結晶區中，分子鏈光滑平整，布列整齊、緊密。在纖維素無定形區，分子鏈排列較松散。右圖顯示，秸稈降解后表面已經被嚴重破壞，結晶區與無定形區沒有差別,纖維束斷裂、粗糙，出現了空化現象。利用纖維素酶降解，對打開秸稈的糖苷鍵有明顯的促進作用，因此可以提高降解率[14]。

2.4 驗證實驗

利用響應面軟件建立秸稈降解的最優條件如下：pH值為5.53,酶解時間為119.47 min，酶解溫度為54.98 ℃，酶用量為0.1 g/g秸稈。此時，還原糖濃度達到最大值，為0.160 777 mg/mL。根據響應面所建立的最優降解條件在實際操作中難以控制，故將優化的降解條件調整如下：pH值為5.5，酶解時間為120 min，酶解溫度為55 ℃，酶用量為0.1 g/g秸稈。根據調整后的最優條件，進行3組平行驗證實驗，測定OD值，計算出還原糖的濃度分別為0.162、0.161、0.159 mg/mL，平均值為0.1 606 mg/mL，實際值與響應面建立的擬合較好，從而驗證了利用該模型進行秸稈降解的可行性。

3 結論

本研究運用響應面法對市售的這種纖維素酶降解玉米秸稈的條件進行優化，最終確立酶促反應最佳條件如下：pH值為5.5，酶解溫度為55 ℃，酶解時間為120 min，酶用量為0.10 g/g秸稈。此時降解后的秸稈中還原糖濃度為0.161 mg/mL。纖維素是取之不盡的天然資源，面對日益嚴重的能源短缺問題，我們要深入研究可再生能源，積極探索秸稈的處理工藝。