蠲痹湯加味防治大鼠膝骨性關節炎的實驗研究

周沛， 賈雪芹， 李梓灝， 黃剛

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東廣州 510120；3.南方醫科大學中西醫結合醫院，廣東廣州 510320）

膝骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種膝關節軟骨損傷，伴有骨質增生、滑膜炎等的退行性病變，占所有骨性關節炎的50%，多發于老年人和絕經后女性[1]。據調查，我國KOA患病率為15%，老年人群高達37%[2-3]。隨著人口老齡化、肥胖等危險因素的增加，KOA 的發病率呈現上升的趨勢。KOA 可以導致關節疼痛、腫脹、畸形和關節功能障礙，嚴重影響患者的生活質量。因此，積極治療KOA 對提高患者關節功能和改善生活質量具有重要的意義。目前，除關節鏡下手術外，現代醫學對KOA 主要以抗炎、鎮痛等治療為主，雖然可減輕疼痛，但是無法延緩病情進展和修復關節等，效果不甚理想[4]。KOA屬于中醫學“痹證”范疇，其病機主要為腎虛、風寒濕痹阻，臨床常應用蠲痹湯加減治療KOA[5]。本課題組應用蠲痹湯湯加味治療KOA 取得良好的療效，但其具體機制尚不明確。有研究表明，炎癥反應、氧化應激反應和細胞外基質在KOA 的發生、發展中起到重要的作用[6]。因此，本實驗復制了KOA大鼠模型，觀察蠲痹湯加味對KOA 大鼠關節活動范圍、關節滑膜厚度和血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素 1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素9（IL-9）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、基質金屬蛋白酶3（MMP-3）、組織金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）水平的影響，探討其防治KOA的作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，8周齡，體質量150 ～170 g，普通飼料喂養，飼料和大鼠均購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物飼養于廣東省中醫院中心實驗室動物實驗中心，許可證號：SYXK（粵）2018-0094。

1.2藥物蠲痹湯加味組成：羌活15 g，獨活15 g，肉桂3 g，秦艽15 g，當歸15 g，川芎15 g，炙甘草6 g，海風藤15 g，桑枝15 g，乳香10 g，木香10 g，杜仲20 g，桑寄生20 g。中藥飲片均由廣州中醫藥大學第二附屬醫院提供。將上述中藥飲片加8倍量的水浸泡30 min 后，煎煮40 min，取藥液過濾另存，再加6 倍量的水煎煮40 min 后取液過濾，將2 次藥液混合，于100 ℃濃縮至100 mL，相當于原藥1.74 g，置于冰箱4 ℃保存備用。鹽酸氨基葡萄糖膠囊，浙江誠意藥業股份有限公司生產，批號：20161024。

1.3試劑與儀器大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9 酶聯免疫吸附反應（ELISA）試劑盒[齊一生物科技（上海）有限公司]；大鼠血清NO、MDA、SOD、TGF-β1、MMP-3、TIMP-1 ELISA 試劑盒（上海恒渡生物科技有限公司）。WT5003CH電子天平（常州萬泰天平儀器有限公司）；AXTG16G 臺式高速離心機（江蘇省鹽城市安信實驗儀器有限公司）；SuPerMax 3000FA多功能酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）；快進千分尺（上海首豐精密儀器有限公司）；TESA 刻度量角器（上海尚銘計量儀器科技有限公司）。

1. 4動物分組、造模與干預所有SD 大鼠給予普通飼料進行適應性喂養1 周后，隨機分為正常組、模型組、蠲痹湯加味組、氨基葡萄糖組，每組各15 只。參照Panicker等[7]方法制備大鼠KOA模型：戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水0.2 mL 注射進大鼠的右膝關節腔內，隔3 d注射1 次，連續注射3 次。2 周后即可獲得穩定的KOA 模型。而正常組右膝關節腔注射等劑量的生理鹽水。獲得穩定的KOA 模型后，按照實驗動物與人體表面積等效量換算比例[8]計算大鼠的給藥劑量，蠲痹湯加味組給予蠲痹湯加味4.348 g·kg-1·d-1灌胃，氨基葡萄糖組給予鹽酸氨基葡萄糖膠囊86.400 g·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。連續灌胃8 周。8周后檢測指標。

1.5實驗室指標檢測8 周后，最后一次給藥后禁食12 h 以上，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，經腹主動脈取血10 mL，以3 000 r/min 離心20 min后取上清液，-70 ℃保存。采用ELISA法檢測大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9、NO、MDA、SOD、TGF-β1、MMP-3、TIMP-1的水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.6大鼠關節活動度對麻醉狀態下的大鼠，用刻度量角器測量右膝關節在外力作用下伸展至回縮的角度。

1.7大鼠關節滑膜厚度打開大鼠右膝關節腔后刮取滑膜組織，用快進千分尺測定關節滑膜厚度。

1.8統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠關節活動度和滑膜厚度的比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的關節活動度顯著減小，關節滑膜厚度顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，蠲痹湯加味組和氨基葡萄糖組大鼠的關節活動度顯著增加，關節滑膜厚度顯著減小，差異均有統計學意義（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

表1 各組大鼠關節活動度和滑膜厚度的比較Table 1 Comparison of the joint mobility and synovial thickness in various groups （x ± s）

2. 2各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9水平的比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，蠲痹湯加味組和氨基葡萄糖組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9水平的比較Table 2 Comparison of the serum TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-9 levels in various groups [x±s，ρ/（pg·mL-1）]

2.3各組大鼠血清NO、MDA、SOD水平的比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清NO、MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，蠲痹湯加味組和氨基葡萄糖組大鼠血清NO、MDA水平顯著降低，SOD 水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

表3 各組大鼠血清NO、MDA、SOD水平的比較Table 3 Comparison of the serum NO，MDA and SOD levels in various groups （x ± s）

2.4各組大鼠血清TGF-β1、MMP-3、TIMP-1水平的比較表4結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-3 水平顯著升高，TGF-β1、TIMP-1水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，蠲痹湯加味組和氨基葡萄糖組大鼠血清MMP-3 水平顯著降低，TGF-β1、TIMP-1水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），且2個治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清TGF-β1、MMP-3、TIMP-1水平的比較Table 4 Comparison of the serum TGF-β1，MMP-3 and TIMP-1 levels in various groups [x±s，ρ/（pg·mL-1）]

3 討論

中醫學認為膝骨性關節炎（KOA）屬本虛標實之病，本虛在于肝腎虧虛，標實為風、寒、濕、瘀痹阻。肝腎虧虛，正氣不足，不能抵抗外邪，風、寒、濕邪合而侵襲，痹阻關節筋脈，致血行不暢，滯而成瘀，風寒濕瘀痹阻，不通則痛，留注關節，致關節腫脹畸形，發為痹病[9]。因此，中醫治療此病以補益肝腎、散寒除濕、活血化瘀為主。蠲痹湯出自《醫學心悟》，具有散寒、除濕、祛風等功效，本研究方藥在蠲痹湯基礎上加味而成。方中杜仲、桑寄生補益肝腎、壯筋強骨，肉桂補火助陽、散寒通脈，當歸、川芎活血化瘀，當歸兼有補血作用，活血而不傷正，乳香行氣活血、化瘀通脈，羌活、獨活散寒止痛、祛風除濕，秦艽、海風藤祛風除濕、通絡止痛，桑枝祛風濕、利關節、止痹痛，甘草調和諸藥。諸藥合用，共奏補益肝腎、活血化瘀、祛風除濕等功效。

關節腔注射木瓜蛋白酶是最常用的KOA 大鼠模型造模方法，本實驗應用此方法建立了大鼠KOA 模型，結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9、NO、MDA、MMP-3水平明顯升高，SOD、TGF-β1、TIMP-1水平明顯降低，關節活動范圍減小，關節滑膜厚度增加（均P＜0.05）。提示KOA 大鼠模型造模成功，且KOA 大鼠存在炎癥反應、氧化應激反應和細胞外基質降解等病理機制。

炎癥反應是軟骨退變的主要原因之一，主要表現為TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9等炎癥因子水平升高。TNF-α 可以誘導骨母細胞釋放破骨細胞活化因子，促進破骨細胞的骨吸收，同時促進軟骨細胞釋放膠原酶，破壞軟骨細胞外基質[10]。IL-1β 可以促進軟骨細胞分泌NO 和基質金屬蛋白酶（MMPs），導致軟骨細胞凋亡和促進軟骨細胞外基質的降解[11]。IL-6可以促進破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞，促進骨吸收和成纖維細胞增殖，還可以促進IL-1β 分泌MMPs，導致軟骨細胞外基質的降解[12]。IL-9 參與骨髓樣白血病細胞系的增長，與關節血管增生密切相關[13]。本研究結果顯示，蠲痹湯加味可以降低KOA 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9 水平，增加關節活動范圍和減小關節滑膜厚度。提示蠲痹湯加味可能通過抑制炎癥反應從而改善KOA。

氧化應激反應在膝關節退變具有重要的作用。NO可以抑制軟骨細胞增殖、降低軟骨的修復能力，還可以促進軟骨基質的降解，加速軟骨破壞[14]。MDA 反映氧化損傷的嚴重程度，可以抑制軟骨細胞增殖、促進細胞外基質的降解[15]。SOD反映機體的抗氧化程度，可以清除MDA 等氧自由基，修復損傷的關節軟骨[15]。本研究結果顯示，蠲痹湯加味可以降低KOA 大鼠血清NO、MDA 水平，提高SOD 水平，增加關節活動范圍和減小關節滑膜厚度。提示蠲痹湯加味可能通過降低KOA大鼠的氧化應激從而改善KOA。

細胞外基質的降解與合成在膝關節退變中同樣具有重要的作用。TGF-β1可以調節細胞生長和分化，可以抑制炎癥反應，促進軟骨合成，抑制膠原和蛋白多糖的降解，抑制細胞外基質的降解，在關節修復和重建中起到重要的作用[16]。MMP-3 可以促進軟骨基質中蛋白多糖的降解，激活膠原蛋白酶，從而促進II 型膠原的降解，是促進細胞外基質降解的最重要因子[17]。TIMP-1 是MMP-3的特異性抑制因子，通過與MMP-3發生不可逆性結合，從而抑制細胞外基質的降解[18]。本研究結果發現，蠲痹湯加味可以降低KOA 大鼠血清MMP-3 水平，提高 TGF-β1、TIMP-1 水平，增加關節活動范圍和減小關節滑膜厚度。提示蠲痹湯加味可能通過抑制KOA 大鼠關節腔的細胞外基質降解從而改善KOA。

綜上所述，蠲痹湯加味可能通過抑制膝骨性關節炎大鼠的炎癥反應、氧化應激反應與軟骨基質的降解，從而發揮防治KOA的作用。