通膽湯對原發性膽汁性膽管炎模型小鼠Mac-2BP表達的影響

唐海鴻， 張彩鳳， 周利軍， 姜小艷， 魏春山， 童光東

（1.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東深圳 518033；2.深圳市寶安區石巖人民醫院，廣東深圳）

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種以慢性肝內膽汁淤積為特征的自身免疫性疾病[1]。熊去氧膽酸（ursodesoxycholic acid）仍是一線用藥，但只能使60%左右的患者在治療1年后達到生化應答，從而延緩疾病的進展[2]，生物化學應答不佳是PBC 患者死亡、肝移植或肝臟并發癥的獨立風險因素[3-4]。本課題組前期長達12 年的臨床研究顯示，通膽湯聯合熊去氧膽酸治療可以明顯延緩早中期PBC患者的疾病進展[5]。為進一步探討通膽湯的干預作用及機制，本研究采用2-辛炔酸結合牛血清白蛋白（2OA-BSA）對Mac-2 結合蛋白（Mac-2BP）基因敲除及野生型C57BL/6小鼠進行造模，使其從生化、免疫及病理上出現類似PBC的慢性膽汁淤積表現，再給予通膽湯進行干預，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1實驗動物SPF 級C57BL/6 小鼠，雌雄各半，5 ～ 6 周齡，體質量15 ～ 22 g。Mac-2BP 基因敲除C57BL/6 小鼠，基因名稱：Lgals3bp（lectin，galactoside-binding， soluble， 3 binding protein），GenBank ID：19039。4對純合子小鼠（詳見圖1、2鑒定結果），繁殖到60 只，每代均進行純合子檢測?；蚯贸鸵吧虲57BL/6 小鼠均購自賽業（廣州）生物科技有限公司，動物質量合格證號：444102017042108。

1. 2通膽湯及其流浸膏制備通膽湯由瓜蔞皮30 g、絲瓜絡30 g、橘絡15 g、青皮15 g、生地黃20 g、熊膽粉0.5 g組成。由我院中藥制劑科制成濃縮膏，其中，熊膽粉是在藥物冷卻后再加入一起攪拌，旋轉風干多余的水分。按照人與實驗動物之間藥物劑量的換算公式[6]，計算小鼠的等效劑量為15.0 g·kg-1·d-1，確定生藥含量為2.1 g/mL（實驗中灌胃劑量為0.02 mL/g），于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3試劑與儀器含H37RA結核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（美國Sigma Aldrich 公司，10 mL/支，批號：F5506）；百日咳毒素（北京博蕾德公司，50 μg/支）；生化檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis 試劑盒、SuperMixTransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司；Mac-2BP 抗體（美國Proteintech Group 公司）。全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）；H1850R 臺式冷凍離心機（湘儀公司 ）； EG11504 脫 水 機 、 ASP300S 包 埋 機 、EG1150C 冷卻臺及 RM2235 切片機（德國 Leica 公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；ABI 7500 熒光定量PCR 擴增儀（美國ABI 公司）；垂直電泳槽和轉膜系統（美國Bio-Rad 公司）；天能5200 凝膠成像系統（上海天能儀器有限公司）。

1.4 PBC小鼠模型的構建2OA-BSA的制備參考Wakabayashi 等[7]的研究。C57BL/6 野生型小鼠30只，基因敲除小鼠25 只，其中5 只野生型小鼠注射等量生理鹽水作為空白對照組，其余小鼠在造模第1天和第3天腹腔注射混合溶液：50 μL 2OABSA 溶液[100 μg 2OA-BSA 溶于 50 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）]、50 μL 含H37RA 結核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（H37RA 濃度為1 mg/mL）和100 μL 百日咳溶液（濃度為1 ng/μL 的百日咳毒素PBS 溶液）。造模第3 周時統一單次給藥，每只小鼠腹腔注射100 μL混合溶液（100 μg 2OA-BAS 溶于50 μL PBS，并輔以50 μL不完全弗氏佐劑）。造模第8周時，取對照組5 只小鼠以及2 組造模小鼠各5 只，通過眼眶靜脈叢采集血液標本進行生化學檢測，另取肝組織行蘇木素-伊紅（HE）染色。

1.5分組與給藥模型鑒定后，對PBC模型構建成功的C57BL/6小鼠進行分組。A組：Mac-2BP基因敲除小鼠，共20 只；B 組：野生型C57BL/6 小鼠，共20 只。采用完全隨機數字法，A 組隨機分為A1、A2 組，B 組隨機分為 B1、B2 組，每組小鼠各10 只。其中：A1、B1 組為對照組，給予等劑量PBS 灌胃；A2、B2 組為干預組，按體質量給予通膽湯流浸膏灌胃。每天1 次，連續干預12 周。干預12 周后全部處死，采集血液標本進行生化指標檢測，取肝組織-80 ℃凍存備用。

1.6觀察指標與方法

1.6.1 肝組織HE 染色 處死小鼠分離肝臟組織以40 g/L多聚甲醛固定，經乙醇梯度脫水后，二甲苯處理增加組織透明度，浸蠟、包埋，組織切片（厚度4 μm）貼于載玻片上，進行HE染色，二甲苯充分透明后中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理結構變化。

1.6.2 生化檢測 采血并應用全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（T-BIL）、γ-谷氨酰轉移酶（GGT）和白蛋白（ALB）的含量。操作方法參考試劑盒內說明書。

1. 6. 3 定量聚合酶鏈反應（q-PCR）檢測肝組織Mac-2BP mRNA表達 取肝組織，用TRIzol法提取RNA，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis 試劑盒進行反轉錄，SuperMixTransStart Top Green qPCR SuperMix 試劑盒進行PCR 檢測。Mac-2BP 基因上游引物序列：5’-GAACCTTTTGGATGCCCACG-3’；下游引物序列：5’-CGTGGTATCGTTGGAGCAGA-3’。內參為GAPDH。擴增反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個循環。

1.6.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測肝組織Mac-2BP 蛋白表達 取凍存肝組織裂解，勻漿，用考馬斯亮藍染色法對上清液進行蛋白質定量，各組取50 μg蛋白進行電泳。電泳結束后轉膜，脫脂奶粉封閉，一抗、二抗孵育，電化學發光（ECL）顯色，天能5200 全自動化學發光圖像分析系統檢測分析。

1.7統計方法采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（x±s）表示。多組比較采用單因素方差分析。采用Levene 法檢驗方差齊，如果方差齊，采用F檢驗進行總均值比較。采用SNK 法進行兩兩比較，如Levene 法檢驗，方差不齊，改用Dunnett T3 或Dunnett T2 檢驗進行兩兩比較。對于2組之間的肝功能指標變化采用配對T檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠Mac-2BP基因敲除鑒定Mac-2BP 基因位于C57BL/6 小鼠的11 號染色體，共鑒定出6 個外顯子，其中外顯子2 中的ATG 為起始密碼子，外顯子6 中的TAA 為終止密碼子（轉錄本：ENSMUST00000043722）。選擇外顯子作為靶位點。Cas9和gRNA被共同注射到受精卵中以用于Mac-2BP基因敲除C57BL/6小鼠生產，所得幼崽將通過PCR 進行基因分型及測序分析，并確定該基因敲除成功。具體見圖1、2。

WT 野生型C57BL/6 小鼠的PCR 結果顯示，Mac-2BP基因敲除成功，8只小鼠樣本全部只得到目標片段，敲除結果得到初步驗證。再經測序確認敲除Mac-2BP 基因2-5 外顯子片段。堿基序列比對達到敲除目標，剩余目標片段609 bp 堿基。測序PCR 引物，F1：5’-AGTATCCCTCTCTAGTAT GGGTGAC-3’。

2. 2 Mac-2BP基因敲除小鼠逐代繁殖及純合子鑒定采用廣州賽業生物提供的純合子鑒定方法，分別進行2 次PCR 檢測。新生小鼠首先使用F1/R1引物PCR鑒定，獲得609 bp條帶說明為基因敲除陽性小鼠（此時不能區分純雜合子），結果見圖3。然后使用F2/R2 引物對陽性小鼠再次進行PCR 鑒定，如果588 bp 處有條帶，說明小鼠是雜合子，沒有588 bp 條帶的為Mac-2BP 基因敲除小鼠純合子，結果見圖4。共鑒定了320 只Mac-2BP基因敲除小鼠，最后篩出來60 只Mac-2BP 基因敲除小鼠純合子，用于后續實驗。F1：5’-AGTATC CCTCTCTAGTATGGGTGAC-3’；R1：5’-TTCCA AAGTTCCAGTCTCTCTCTGC-3’。目的條帶大小609 bp。F2：5’-AGTATCCCTCTCTAGTATGGGTG AC-3’；R2：5’-AGAAGGGGTGAAAGCTCTGATG AC-3’。目的條帶大小588 bp。

2.3 PBC模型小鼠的造模結果Mac-2BP 基因敲除小鼠與正常小鼠在形態上無區別。5 ～6 周齡時開始造模，小鼠平均體質量為（16.5 ± 0.84）g。隨著造模時間的延長，2 組小鼠逐漸出現食欲減退、精神萎靡及反應遲鈍等表現，體質量較造模前出現下降，造模后平均體質量為（13.1±0.91）g（P＜0.05，與造模前比較）。造模后的小鼠肝臟均較對照組增大，色澤變黃，見圖5。但正常組與基因敲除組小鼠造模后形態外觀上無明顯差異。所有造模小鼠肝臟病理顯示淋巴細胞在匯管區輕度浸潤，特別是損傷的小葉內膽汁導管，在一些匯管區中觀察到膽管損失和上皮樣肉芽腫，并且在肝實質中也發現肉芽腫，在病理上其改變與人PBC的肝臟病理存在較好的一致性。見圖6。

圖1 C57BL/6小鼠Mac-2BP基因敲除PCR鑒定Figure 1 PCR identification of Mac-2BP gene knockout in C57BL/6 mice

圖2 C57BL/6小鼠Mac-2BP基因敲除測序結果Figure 2 Sequencing results of Mac-2BP gene knockout in C57BL/6 mice

圖3 F1/R1引物PCR擴增結果Figure 3 PCR amplification results of F1/R1 primer

圖4 F2/R2引物PCR擴增結果Figure 4 PCR amplification results of F2/R2 primer

圖5 對照組與PBC模型（A、B組）小鼠肝臟外觀形態比較Figure 5 Comparison of liver appearance in control group and model mice（group A，B）

2. 4 PBC模型小鼠肝功能指標檢測結果造模8 周后，A組、B組小鼠的ALT、AST、ALP、TBil、GGT 水平較對照組均顯著升高（P＜ 0.01），ALB 水平較對照組顯著降低（P＜0.01），見表1。表明模型小鼠肝功能指標改變主要以ALP 及GGT 升高為主，伴隨有ALT、AST 的升高和ALB 的明顯下降，結合小鼠肝臟病理觀察，提示在一定程度上符合人類PBC的表現。

圖6 對照組與PBC模型小鼠肝組織病理變化比較（HE染色）Figure 6 Comparison of the pathological changes in liver tissue of the control group and PBC model mice（by HE staining）

2. 5各組PBC小鼠肝組織Mac-2BP蛋白表達比較圖7 結果顯示：A1、A2 組肝組織Mac-2BP蛋白均沒有明顯表達；與B1 組比較，B2 組Mac-2BP 的蛋白表達量明顯下降，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。

2.6各組PBC小鼠肝組織Mac-2BP的mRNA表達比較圖8 結果顯示：A1、A2 組肝組織Mac-2BP mRNA 均沒有明顯表達；與B1 組比較， B2 組Mac-2BP 的mRNA 表達量明顯下降，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。

2. 7各組PBC小鼠肝功能比較表2 結果顯示：干預后，A、B 組組內 AST、ALT、ALP、Tbil 及GGT 水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），但A 組組內的ALB 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。A1 組肝功能指標與B1 組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。A2組ALT、ALP、GGT水平較B2組降低，ALB水平較B2組升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表明通膽湯均可顯著改善Mac-2BP基因敲除小鼠和野生型C57BL/6小鼠的肝功能情況，且對野生型C57BL/6小鼠肝功能的改善作用優于對Mac-2BP基因敲除小鼠的改善作用。

3 討論

既往研究多應用α-異硫氰酸萘酯（ANIT）誘導構建動物原發性膽汁性膽管炎（PBC）模型，但ANIT 所致的膽汁淤積模型更符合急性膽汁淤積的病理 及 生化改變[8]。Wakabayashi 等[7]在 C57BL/6 小鼠中以外源性物質2OA-BSA 輔以完全弗氏佐劑腹腔內注射免疫誘導并觀察至24 周，結果顯示模型小鼠出現自身免疫性膽管炎、血清AMA 陽性、肝組織內浸潤的淋巴細胞數量增加，后者尤指共表達CD44的CD8+T細胞。張慧等[9]研究發現，按照上述方法誘導8 周，模型小鼠肝組織可見匯管區周圍和肝內小膽管周圍有大量炎性細胞浸潤，認為該小鼠PBC造模方法可行性強，形成周期短，穩定可靠。本研究亦應用2OA-BSA 誘導8 周構建C57BL/6小鼠PBC模型，結果顯示模型小鼠肝臟組織病理及血清生化指標變化能較好地模擬人PBC的相關病理變化，且野生型小鼠與Mac-2BP基因敲除小鼠在生化及肝臟組織病理改變上無明顯差異。

表1 對照組與PBC模型小鼠肝功能指標比較Table 1 Comparison of liver function indicators in control group and PBC model mice （x ± s）

圖7 各組PBC小鼠肝組織Mac-2BP蛋白表達比較（x±s）Figure 7 Comparison of the protein expression level of Mac-2BP in liver tissue of PBC mice in various groups（x ± s）

圖8 各組PBC小鼠肝組織Mac-2BP的mRNA表達比較（x ± s）Figure 8 Comparison of the mRNA expression level of Mac-2BP in liver tissue of PBC mice in various groups（x ± s）

本研究是采用CRISPR-AI 敲除C57BL/6 小鼠精子，使其進行繁殖，然后產生純合子的Mac-2BP基因缺陷C57BL/6 小鼠，該過程大概需要16 周左右的時間。再以該鼠繁殖至實驗所需要的數量，一共繁殖了320只Mac-2BP基因敲除小鼠，最后篩選出60 只純合子Mac-2BP 基因敲除小鼠，用于后續實驗。結果顯示使用該方法獲得基因敲除小鼠，其純合子小鼠的比例是比較低的，且耗時較長。但在造模及干預當中，小鼠的死亡率不到10%。

表2 各組PBC小鼠肝功能比較Table 2 Comparison of liver functions in PBC mice of various groups （x ± s）

近年來中西醫結合治療PBC 顯示出一定的療效[10-11]。本課題組前期臨床應用通膽湯聯合熊去氧膽酸治療可以明顯延緩早中期PBC 患者的疾病進展[5]。通膽湯主要根據全國名老中醫朱良春教授治療膽石癥及膽囊炎經驗而成，方中：瓜蔞皮，味甘、微苦、性寒，能寬胸降氣、消痰開結，可蕩滌胸中郁熱垢膩，重用為君藥；絲瓜絡祛風通絡、化痰除濕，其脈絡與肝內膽管及血管走形類似，有取類比象之意，重用為臣；青皮行氣引經、疏肝利膽，合為臣藥，腑氣以通為順，行氣通腑藥物有利膽消炎及排泄毒素等作用，有利于膽囊炎及淤膽等病情的緩解；熊膽粉為黑熊的干燥膽汁，能清肝明目，在世界第一本國家藥典《唐本草》中就有關于干黑熊膽汁治療黃疸的記載。

Mac-2BP 是廣泛表達的分泌型糖蛋白，一直被視為與疾病診斷、預后差和對治療反應不佳相關的重要臨床標記物[12]。研究表明，Mac-2BP主要在腫瘤疾病中高表達[13-14]，可能與活化血管內皮細胞導致腫瘤相關血管生成有關[15]。Mac-2結合蛋白與人巨噬細胞相關凝集素Mac-2結合[16]。有學者提出了血清多花紫藤凝集素陽性巨噬細胞結合蛋白[Wisteria floribunda agglutinin- positive Mac- 2 binding protein，WFA（+）-M2BP]水平可以預測肝纖維化進展及肝癌的發生[17-19]。本研究結果顯示，通膽湯可改善PBC 模型小鼠的生化學指標，且對野生型小鼠生化學指標的改善作用較基因敲除型小鼠更為明顯，結合野生型小鼠Mac-2BP 的表達情況，通膽湯干預后野生型小鼠的Mac-2BP 表達量明顯降低，認為通膽湯改善PBC 小鼠的膽汁淤積情況，可能與下調Mac-2BP 的表達相關，但其具體機理有待進一步研究。