大孔吸附樹脂分離粉花繡線菊根中總黃酮工藝研究

繆艷燕，陳麗聰，徐劍

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

0 引言

粉花繡線菊（Spiraea japonica L. f.）為薔薇科繡線菊屬植物，主要分布于西南地區(qū)、華東地區(qū)以及內(nèi)蒙古自治區(qū)。現(xiàn)代研究表明，繡線菊屬植物含有生物堿、黃酮、萜類、酚類等多種化學(xué)成分，具有抗菌、抗病毒、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等多種生物活性，目前研究較多是二萜生物堿類成分[1]。前期研究中發(fā)現(xiàn)粉花繡線菊中含有含有生物堿、黃酮、揮發(fā)油、糖類等成分，而黃酮類化合物具有多種生物活性，在抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等方面作用顯著，對心血管系統(tǒng)疾病也有著顯著療效。本課題期望通過大孔吸附樹脂分離純化粉花繡線菊總黃酮，為后續(xù)粉花繡線菊總黃酮的藥理活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器。UV-5900紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；JM-A10002電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；15×200 mm層析柱。

1.2 藥材與試劑。粉花繡線菊植物（龍里縣灣灘河鎮(zhèn)灣寨鄉(xiāng)采收，經(jīng)我院嚴(yán)福林老師鑒定）；D101、AB-8、DM-130型大孔吸附樹脂（蚌埠遼源新材料有限公司）；H-30、ADS-17型大孔吸附樹脂（長沙承禹化工有限公司）；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號100080-201409）。

2 方法與結(jié)果

2.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理。將大孔吸附樹脂置于燒杯中，95%乙醇浸泡過夜，濕法裝柱后，用95%乙醇沖洗樹脂柱，至流出液與三倍量蒸餾水混合無渾濁；再用蒸餾水過柱，直至流出液無醇味。用2BV 1% HCL 溶液通過樹脂柱，浸泡2 h后用蒸餾水洗至流出液呈中性；最后用2BV 1% NaOH溶液過樹脂柱，浸泡2 h后用蒸餾水洗至流出液呈中性[2]。

2.2 靜態(tài)吸附。精密稱取預(yù)處理的H-30，ADS-17，AB-8，D101，DM130樹脂（用濾紙吸干）各3.000 g，分別置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入粉花繡線菊醇提液15.0 mL，吸附24 h，過濾，測定濾液中總黃酮含量，計(jì)算靜態(tài)吸附量以及吸附率，結(jié)果見圖1。

圖1 五種大孔吸附樹脂對總黃酮靜態(tài)吸附結(jié)果

2.3 靜態(tài)解吸。將上述五種靜態(tài)吸附的大孔樹脂分別置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液[10]50 mL，常溫下解吸24 h，過濾，測定濾液中總黃酮的含量，計(jì)算靜態(tài)解吸量和解吸率，結(jié)果如圖2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以吸附率為指標(biāo)，吸附效果由高到低依次為：AB-8＞ADS-17＞ H-30＞ D101＞DM130；以解吸率為指標(biāo)，解吸效果由高到低依次為：AB-8＞D101＞ADS-17＞H-30＞DM130。綜上可知，AB-8對總黃酮的吸附性和解吸性均最好，因此選擇AB-8型大孔吸附樹脂分離純化粉花繡線菊根中總黃酮。

圖2 五種大孔吸附樹脂對總黃酮靜態(tài)解吸結(jié)果

2.4 泄漏點(diǎn)的確定。精確量取預(yù)處理的AB-8型大孔吸附樹脂20 mL（濕樹脂），濕法裝柱（1.5 cm×20 cm），將粉花繡線菊總黃酮液240 mL（濃度為0.5039 mg·mL-1）以0.5 mL·min-1的流速過樹脂柱，每10 mL收集1份流出液，紫外分光光度法測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。當(dāng)上柱藥液達(dá)在60 mL時(shí)，流出液中總黃酮濃度達(dá)到上樣液濃度的十分之一，總黃酮在樹脂上的泄漏點(diǎn)為3 BV，為了節(jié)約和增效，故確定上樣體積為2.5 BV。

2.5 洗脫劑濃度對解吸的影響。精密量取處理好的AB-8型大孔吸附樹脂20 mL，濕法裝柱（15×200）三份。取三份粉花繡線菊總黃酮液，各50 mL（濃度為0.5039 mg·mL-1），以0.5 mL·min-1的流速上樣，收集流出液，用紫外分光光度法測定并計(jì)算流出液中總黃酮含量。上樣后用5 mL蒸餾水通過樹脂柱除雜，再分別用30%、50%、70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇各40 mL以0.5 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用紫外分光光度法測定并計(jì)算洗脫液中總黃酮，結(jié)果如表1。

表1 不同濃度洗脫溶劑對解吸的影響

由表1可知，50%乙醇對粉花繡線菊總黃酮的解吸率較高，故選用50%乙醇進(jìn)行洗脫。

2.6 洗脫劑用量的確定。精密量取處理好的AB-8型大孔吸附樹脂20 mL，濕法裝柱，按“2.5”項(xiàng)下方法上樣，50%乙醇以0.5 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫，每10 mL收集1次洗脫液，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量并繪制動(dòng)態(tài)解吸曲線，結(jié)果如圖3。

圖3 洗脫劑用量考察

由圖可知，當(dāng)洗脫液用量到達(dá)70 mL（7 BV）時(shí)，曲線逐漸趨于平衡，說明粉花繡線菊總黃酮已接近充分洗脫。從節(jié)約溶劑角度，選擇5BV為洗脫劑用量。

2.7 上樣流速對解吸的影響。精密量取預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂20 mL，濕法裝柱（15×200）三份。取三份上樣溶液各50 mL（濃度0.9511 mg·mL-1），分別以0.5 mL·min-1，0.8 mL·min-1，1.0 mL·min-1的流速上樣，收集流出液，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量及吸附率，結(jié)果如表2。

表2 上樣流速的考察

由表2可知，當(dāng)上樣流速為0.5 mL·min-1時(shí)，AB-8型大孔吸附樹脂對總黃酮的吸附率為77.53%，隨著上樣流速逐漸增大，樹脂對總黃酮的吸附會(huì)逐漸降低。故選擇上樣流速為0.5 mL·min-1。

2.8 上樣溶液pH對解吸的影響。精密量取預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂20 mL，濕法裝柱（15×200）三份。用5%HCL或5%NaOH溶液調(diào)節(jié)總黃酮溶液（濃度0.6674 mg·mL-1）pH至4、6、8，上樣50 mL后以0.5 mL·min-1的流速通過樹脂柱，收集流出液，測定流出液中吸光度，計(jì)算總黃酮含量及吸附率，結(jié)果見表3。

表3 上樣溶液pH的考察

由表3可知，總黃酮溶液pH值為4時(shí)，吸附率為87.37%，隨著pH值的增大，吸附率逐漸降低；說明當(dāng)上樣溶液呈酸性時(shí)，大孔樹脂對總黃酮的吸附效果較好，在偏堿性條件則吸附性能降低。

2.9 上樣溶液濃度對吸附性能的影響。精密量取經(jīng)預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂20 mL，濕法裝柱（15×200）3份。1份取粉花繡線菊提取液（濃度為0.7740 mg·mL-1）40 mL，另2份分別稀釋至50 mL（濃度為0.6192 mg·mL-1）和60 mL（濃度為0.5160 mg·mL-1），以0.5 mL·min-1的流速通過樹脂柱，收集流出液，用紫外分光光度法測定流出液中總黃酮含量，計(jì)算吸附率，結(jié)果如表4。

表4 上樣溶液濃度考察

由表4可知，上樣濃度太大不利于總黃酮的吸附，上樣溶液濃度為0.5160 mg·mL-1時(shí)，吸附率達(dá)到72.76%。

2.10 洗脫流速對解吸的影響。精密量取預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂20 mL，濕法裝柱（15×200）3份。分別加入上樣溶液50 mL（濃度為0.5456 mg·mL-1），均以0.5 mL·min-1的流速進(jìn)行吸附，收集流出液，用紫外分光光度法測量流出液中總黃酮含量。接著用5 mL蒸餾水通過樹脂柱，再加40 mL 50%乙醇分別以2.4 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.5 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用紫外分光光度法測定總黃酮含量，并計(jì)算洗脫率，結(jié)果如表5。

表5 洗脫流速的考察

由表5可知，50%乙醇洗脫流速為0.5 mL·min-1時(shí)，解吸率可達(dá)到80.65%；但是隨著洗脫流速增大到2.4 mL·min-1時(shí)，解吸率呈下降趨勢，僅為65.31%。說明在進(jìn)行解吸時(shí)，50%乙醇的流速不易太快。

3 討論

3.1 大孔吸附樹脂依靠自身與被吸附分子（吸附質(zhì)）之間的分子間作用力和氫鍵作用發(fā)揮吸附性能，通過吸附性和分子篩原理，不同的有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的差異和分離量大小，在被吸附后經(jīng)一定的溶劑洗脫而達(dá)到分離的目的[4]。影響大孔樹脂分離純化效果的因素其一是樹脂及目標(biāo)成分本身的性質(zhì)，如極性，目標(biāo)成分結(jié)構(gòu)和分子量等；其二是實(shí)驗(yàn)中的變量，如上樣和洗脫的濃度、流速，樹脂用量，洗脫劑，徑高比等[5]。實(shí)驗(yàn)中要對其中主要的因素進(jìn)行考察優(yōu)化。

3.2 本實(shí)驗(yàn)通過對五種大孔吸附樹脂吸附-解吸性能的比較，選擇AB-8型對粉花繡線菊根中總黃酮進(jìn)行分離純化，并通過不同指標(biāo)的考察，最終確定最優(yōu)條件為上樣液濃度0.5160 mg·mL-1，上樣體積2.5 BV，上樣藥液pH4，吸附流速0.5 mL·min-1，洗脫劑50%乙醇，洗脫劑用量5 BV，洗脫流速0.5 mL·min-1。