大黃酚與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞膠原及盤狀結(jié)構(gòu)域受體2的調(diào)控作用及機(jī)制

楊成華 巫岳龍 李敏 程基焱 顏麗萍

(1達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 達(dá)州 635001；2西南醫(yī)科大學(xué)；3泰安護(hù)理職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

成纖維細(xì)胞參與修復(fù)的整個(gè)過程，其分裂、增殖、遷移、合成與分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成結(jié)締組織或瘢痕組織、使創(chuàng)傷修復(fù)，這是目前醫(yī)學(xué)理論中組織創(chuàng)傷后修復(fù)的主要機(jī)制〔1～3〕。細(xì)胞外基質(zhì)中，膠原是最為重要的有形成分，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的膠原至少有10多種類型，其中Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)是最主要成分，是成纖維細(xì)胞修復(fù)組織創(chuàng)傷過程中的主要角色。研究發(fā)現(xiàn)，膠原纖維可以激活盤狀結(jié)構(gòu)域受體(DDR)2，再通過作用于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解膠原參與膠原的合成與分泌及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)〔4,5〕。大黃酚是大黃、蘆薈等多種中藥的有效成分。大黃、蘆薈在中國(guó)的使用有著悠久的歷史，除了可以用于疾病的辨證施治以外，還用于保健和日用化工品中，對(duì)于護(hù)發(fā)和護(hù)膚方面的應(yīng)用尤為常見〔6～8〕。本研究采用體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，用大黃酚干擾，檢測(cè)成纖維細(xì)胞的增殖及對(duì)Col-I、Col-Ⅲ、DDR2表達(dá)的影響，探討大黃酚對(duì)成纖維細(xì)胞的影響及機(jī)制，為成纖維細(xì)胞的功能調(diào)控的研究及中藥大黃、蘆薈在臨床的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源及主要試劑、設(shè)備 人成纖維細(xì)胞細(xì)胞株：北納生物公司；一抗(膠原、DDR2)：上海信裕生物科技有限公司；Western印跡和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒：大黃酚：上海寶曼生物科技有限公司；天根生化科技(北京)有限公司；流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及干擾 將人成纖維細(xì)胞株復(fù)蘇，用1.0×105/L的細(xì)胞濃度接種到培養(yǎng)板，小牛血清10%和DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待3～4 d后增殖到約70%后換用無(wú)血清成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)干擾。細(xì)胞分為對(duì)照組(CG)、TGF組(TTG)、大黃酚組(CTG)。CG常規(guī)培養(yǎng)，TTG以5 μg/ml的TGF-β1干擾，CTG分別以二甲基亞砜為溶劑溶解大黃酚稀釋，以200 μg/ml干擾，24 h后終止干擾，進(jìn)入后續(xù)使用。

1.3實(shí)時(shí)定量(qRT)-PCR檢測(cè)DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞干擾培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，計(jì)算RNA溶液濃度。然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，冰上冷卻，逆轉(zhuǎn)錄，-20℃保存cDNA。PCR條件：95℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)；60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；最后65℃ 15 s。以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行相對(duì)定量分析。采用分析軟件Bio.Rad CFXManager自動(dòng)統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。引物設(shè)計(jì)：DDR2正義5′-GCAACACGTAGAACTCTACCAGAA-3′，反義5′-CAGCCACTCAGGCGTATCA-3′；Col-Ⅰ正義5′-TGCCGTGACGTGAAGATGTG-3′，反義5′-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3′；Col-Ⅲ正義5′-ATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3′，反義5′-TGGGGTTTCAGA GAGTTTGG-3′。

1.4Western印跡檢測(cè)DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞干擾培養(yǎng)48 h后洗滌、收集培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞裂解液4℃，30 min下裂解細(xì)胞，移至離心管，4℃ 12 000 r/min，離心5 min，收集上清，-20℃保存。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，酶標(biāo)儀下波長(zhǎng)562 nm比色繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。置樣品放于96孔板，加二喹啉甲酸(BCA)工作液，酶標(biāo)儀下波長(zhǎng)562 nm比色并記錄各孔吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)蛋白含量。聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，濃縮膠電泳電流為25 mA，分離膠電泳電流為30 mA，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%去脂牛奶封閉，一抗分別與磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.1% Tween-20和5% 去脂牛奶混合，膜放入該混合液中4℃過夜，洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，充分洗滌，曝光，顯影并拍照。Quantity-one軟件分析灰度值，以目的片段的灰度值與相應(yīng)β-actin灰度值的比作為蛋白質(zhì)的相對(duì)水平?？贵w稀釋度：DDR2(1∶500稀釋)，Col-Ⅰ(1∶400稀釋)，Col-Ⅲ(1∶500稀釋)，二抗(山羊抗小鼠，1∶5 000稀釋；山羊抗兔，1∶5 000稀釋)。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 取干擾24 h后的細(xì)胞，胰酶消化，離心后冰乙醇固定。采用5×105/ml的細(xì)胞濃度，再用碘化丙啶(PI)染液孵育染色。流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD公司，型號(hào)BD CSCalibur)下，用488 nm波長(zhǎng)激光激發(fā)，AC Station、Cell QUEST Pro進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn) 采用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR檢測(cè)DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表達(dá)水平 與CG(1.00)比較，TTG、CTG上調(diào)成纖維細(xì)胞的DDR2 mRNA表達(dá)(1.21、1.24)，有顯著性差異(P<0.05)；與CG(1.00)比較，TTG上調(diào)成纖維細(xì)胞的Col-Ⅰ表達(dá)(1.29)，有顯著性差異(P<0.05)；CTG下調(diào)成纖維細(xì)胞的Col-Ⅰ表達(dá)(0.91)，有顯著性差異(P<0.05)；與CG(1.00)比較，TTG略微下調(diào)成纖維細(xì)胞的Col-Ⅲ表達(dá)(0.95)，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CTG上調(diào)Col-Ⅲ表達(dá)(1.08)，有顯著性差異(P<0.05)。

2.2Western印跡檢測(cè)DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)水平 干擾培養(yǎng)各組細(xì)胞24 h后，TTG、CTG的DDR2表達(dá)水平(1.217、1.239)與CG(1.000)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TTG、CTG Col-Ⅰ表達(dá)(1.428)與CG(1.000)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TTG的Col-Ⅲ表達(dá)(0.981)與CG(1.000)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CTG Col-Ⅲ表達(dá)(1.319)與CG比較有顯著性差異(P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)

2.3流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 干擾培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，TTG G1/G0期細(xì)胞所占比例略高于CG，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CTG G1/G0期細(xì)胞所占比例低于CG，有顯著性差異(P<0.05)；TTG與CG S期細(xì)胞所占比例無(wú)顯著性差異(P>0.05)，CTG S期細(xì)胞所占比例高于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)；各組G2期細(xì)胞所占比例無(wú)明顯差異(表1)。

表1 各組流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

組織創(chuàng)傷后的修復(fù)是極為復(fù)雜的問題，成纖維細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的膠原是其主要的參與成分，尤其以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ為主。組織創(chuàng)傷修復(fù)后有大量瘢痕產(chǎn)生，影響了皮膚的美觀，甚至因?yàn)轳：鄣氖湛s、粘連從而影響了器官功能。有研究發(fā)現(xiàn)，胚胎皮膚創(chuàng)傷修復(fù)“無(wú)瘢痕愈合”〔9〕。研究表明，創(chuàng)傷無(wú)瘢痕愈合的主要機(jī)制之一是Col-Ⅲ在細(xì)胞外基質(zhì)中含量增高和(或)與Col-Ⅰ的比例增高〔4～6〕。

TGF-β是一類分泌型多肽細(xì)胞因子，可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞合成及分泌功能，協(xié)調(diào)創(chuàng)傷愈合，加速細(xì)胞外基質(zhì)的合成及沉淀。因此，有學(xué)者認(rèn)為TGF-β1參與膠原的產(chǎn)生、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，甚至是導(dǎo)致瘢痕產(chǎn)生的主要機(jī)制〔10〕。DDR可以和膠原蛋白結(jié)合，參與炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)等過程。研究表明，DDR2可以被膠原激活，再作用于MMPs，進(jìn)一步降解膠原。因此，Col-DDRs-MMPs之間的相互作用存在一個(gè)正反饋環(huán)路，參與組織創(chuàng)傷修復(fù)，膠原降解、膠原排列及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)〔11～14〕。TGF-β1可以明顯通過促進(jìn)Col-Ⅰ的分泌而促進(jìn)組織創(chuàng)傷愈合，但大黃酚卻對(duì)Col-Ⅰ的合成及分泌功能有抑制作用。

從TGF-β1和大黃酚對(duì)DDR2表達(dá)的影響結(jié)果來(lái)看，二者下調(diào)了DDR2的合成與表達(dá)。TGF-β1促進(jìn)Col-Ⅰ的合成與分泌可能是參與組織創(chuàng)傷修復(fù)的作用機(jī)制，即增加細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生而達(dá)到促進(jìn)修復(fù)的作用。TGF-β1導(dǎo)致Col-I分泌的增多則可能上調(diào)了DDR2表達(dá)，再進(jìn)一步降解Col-Ⅰ。大黃酚的作用則可能是直接上調(diào)DDR2表達(dá)，進(jìn)一步降解Col-Ⅰ，同時(shí)促進(jìn)Col-Ⅲ合成，從而增高Col-Ⅲ/Col-Ⅰ的比例，則有可能降低瘢痕產(chǎn)生的可能性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明成纖維細(xì)胞的分裂增殖活性增加。大黃酚促使成纖維細(xì)胞的增殖活性增加則說(shuō)明細(xì)胞的數(shù)量增加較快，有利于產(chǎn)生較多的細(xì)胞外基質(zhì)，有利于組織創(chuàng)傷的修復(fù)〔13～15〕。結(jié)合上述大黃酚對(duì)Col-Ⅲ、Col-Ⅰ表達(dá)的調(diào)控作用，大黃酚雖然抑制成纖維細(xì)胞Col-Ⅰ的表達(dá)，但是可以增加成纖維細(xì)胞的增殖活性，從而促進(jìn)組織創(chuàng)傷的修復(fù)。同時(shí)大黃酚促進(jìn)Col-Ⅲ的表達(dá)，則可能通過該機(jī)制促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的同時(shí)，減少瘢痕的形成。