近10年水產動物抗逆育種研究進展

付璐璐 王崢 王磊 李學軍

摘要：隨著水產養殖業的快速發展，產業對抗逆新品種的需求也在不斷增加，然而目前通過審定的水產新品種大多是以生長性狀為選育指標，抗逆新品種較少。本文通過對近10年國內外水產動物抗逆育種的研究對象、研究方法和研究結果等進行總結分析，以期為今后的水產動物抗逆育種研究提供一定參考。

關鍵詞：水產動物;抗逆;育種;養殖;研究進展

中圖分類號：S917.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0052-06

自1989年以來，我國水產養殖產量長期占據世界第1位，目前已對50多種水生動物進行了規模化養殖[1]，但隨著養殖技術的發展和市場需求的增多，養殖密度不斷增加，從而造成水質環境惡化，水產動物病害隨之發生，開始出現抗逆能力下降、產品質量降低等現象。這些問題的出現與養殖環境、養殖密度、養殖模式及自然氣候等都有關系，缺乏抗逆能力強的品種也是造成這些問題的重要原因之一[2-3]。因此，加快培育抗逆能力強的水產動物新品種是解決以上問題的重要途徑。目前，國內外關于水產動物的育種研究主要集中在生長性狀方面，在抗逆育種研究方面，魚類抗病育種研究較多，而其他種類和其他抗逆性狀的研究相對較少。本文主要通過對近10年國內外的水產動物抗逆育種研究進行總結，以期為培育水產動物抗逆新品種提供參考和依據。

1 魚類抗逆育種研究進展

1.1 抗病育種

國內外對于魚類抗病育種的研究較多，沈夏霜等對吉富羅非魚（GIFT，Oreochromis niloticus）進行了5代家系選育，在2016年得到F5代，并構建了42個家系對其進行了無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）侵染及抗病性篩選。結果顯示，F5代存活率為95%，F0代存活率為64.2%，表明F5代抗病性能相對于F0代得到了顯著提升，抗病性狀相關的優勢基因經5代的選育得到了有效富集[4]。陳松林所在團隊通過巢式雜交、三元雜交、雌核發育以及家系選育等方法研究了牙鲆（Paralichthys olivaceus）對遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）及鰻弧菌（Vibrio anguillarum）的抗侵染能力，共選育出了2個抗病力強的家系，將其雜交培育出了抗病能力強、生長速率快的“鲆優二號”新品種[5-8]。Shao等構建了牙鲆高分辨遺傳圖譜的全基因組SNP，確定了13 362個SNP，是目前報道的最密集的遺傳圖譜，鑒定出了與弧菌抗病性顯著相關的QTL（quantitative trait locus）以及免疫相關基因，廣泛應用于弧菌病抗性QTL定位及基因組分析[9]。2016年，白珊珊等通過篩選錦鯉中抗錦鯉皰疹病毒3型（cyprinid herpesvirus 3，CyHV3）基因相關分子標記進行輔助育種，選育出抗CyHV-3的F3代，對F3代進行抗病性能評估，結果表明，其抗病能力顯著高于F1代（P<0.05），相對于F2代更加穩定[10]。2018年，Sawayama等報道了用分子標記輔助選擇和家系選育相結合的方法培育抗真鯛虹彩病毒病（red sea bream iridoviral disease，RSIVD）的真鯛（Pagrosomus major）品系，選擇具有RSIVD抗性的個體建立基礎群體G0，通過選育建立G1群體，利用與RSIVD抗性性狀連鎖的數量性狀位點（Pma4014）進行分子標記輔助選擇，篩選出具有Pma4014抗性等位基因的G2個體，經養殖試驗得出，2016年和2017年生產的G2種群的存活率分別為78.8%和83.5%，G2群體可作為進一步培育抗RSIVD的真鯛品系基礎群體[11]。Wang等對鲇魚（Silurus asotus）抗運動性氣單胞菌敗血癥（motile Aeromonas septicemia，MAS）開展了一項全基因組關聯研究（GWAS）以篩選數量性狀基因座（QTL），通過嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染試驗，選擇了382個極端表型用于鲇魚690K SNP陣列的基因分型，得出連鎖群（LG）2、26和29上的3個QTL被鑒定為與MAS抗性顯著相關，在這些區域內，共有24個基因具有已知的免疫功能，其中10個參與NF-kB信號通路，表明NF-kB信號通路在MAS抗性中起到重要作用，由于參與MAS抗性的QTL數量有限，因此可以將分子標記輔助選擇作為鲇魚抗MAS育種的一種手段[12]。

1.2 耐高溫和耐低溫育種

耐高溫和耐低溫性狀的遺傳并不穩定，因此選育難度相對較大[13]。劉寶鎖等在對耐高溫能力強的大菱鲆（Scophthalmus maximu）進行選育時，得到的F2代比F1代的耐高溫能力提高了1～2 ℃，此外還得出大菱鲆的體質量與耐高溫性遺傳相關系數為-1.00[13-15]，可作為今后選育耐高溫品系的參考。2013年，Anttila等報道了41個大西洋鮭（Salmo salar）家系的高溫耐受性和低氧耐受性的相關性，家系之間的高溫耐受性和低氧耐受性均顯著不同，臨界最高溫度與低氧耐受性之間存在顯著正相關，即高溫耐受性強品系的低氧耐受能力也強，證明高溫耐受性和低氧耐受性可能存在一些共同的信號通路[16]。2017年，Ineno等報道了通過選擇育種培育的1種耐高溫的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）新品種，對F1代的F1T（耐高溫的品系♀×Nikko品系♂）和F1N（Nikko品系♀×熱選擇的品系♂）進行高溫脅迫，結果顯示，F1代、F1T和F1N的F2后代都顯示出耐高溫性狀，說明培育出的新品種的耐高溫性狀可以穩定遺傳給后代[17]。何金釗等采用人工室內降溫的方法進行低溫脅迫試驗，對比3個品系（關島品系、佛羅里達品系、珍珠白品系）紅羅非魚（Oreochromis niloticus×Oreochromis mssambicus）的耐低溫能力，結果顯示，3個品系的半數致死溫度分別是7.46、6.77、6.68 ℃，珍珠白紅羅非魚的耐低溫能力最強，并提出了在不對魚體造成損傷的情況下通過臨界溫度連續選育的方法培育新品種[18]。

1.3 耐低氧育種

耐低氧性狀是受眾多微效基因控制的數量性狀[19]。Li等采用QTL-seq和ddRAD-seq技術研究尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）耐低氧相關基因，結果顯示，位于全基因組QTL區間的GPR132和ABCG4基因的外顯子中的單核苷酸多態性（SNP）與低氧耐受性狀顯著相關，表明它們可以作為研究羅非魚低氧耐受性的候選基因，為以后進行分子標記輔助育種打下基礎[20]。陳柏湘通過選擇育種建立耐低氧和低氧敏感的基礎群體，對團頭魴（Megalobrama amblycephala）進行耐低氧相關分子標記的篩選，發現了2個與耐低氧相關的SNP分子標記，經試驗證明其與團頭魴耐低氧性狀相關性不顯著（P>0.05），還需進一步研究[19]。李福貴等在培育團頭魴耐低氧新品種時，從鄱陽湖挑選野生和引進的優良品種作為親本進行雜交，經過群體選育得到F1代，低氧脅迫再篩選耐低氧能力強的個體建立F2代，挑選體形好、生長速率高的F2代作為親本建立了F3代，試驗表明，篩選出的F3代不僅耐低氧能力強同時還保持了快速生長的特性[21]。

1.4 耐鹽性育種

Romano等通過雜交育種培育的lemon fin barb hybrid（Hypsibarbus wetmorei ♂×Barbodes gonionotus ♀）經高鹽脅迫證明了其高鹽耐受性得到了提升[22]。Jiang等利用基于ddRAD-seq的GWAS研究成功篩選出了尼羅羅非魚GIFT品系和馬來西亞紅羅非魚（Oreochromis mossambicus×O.niloticus）品系中與耐鹽性相關的QTL，證明了位于尼羅羅非魚系chrLG18的23.0 Mb是主要的QTL區域，控制了紅羅非魚和尼羅羅非魚的耐鹽性狀，為精細定位耐鹽性相關的QTL、分子標記輔助選擇以及培育具有耐鹽性狀的羅非魚提供了基礎[23]。李學軍等采用鹽度致死（MST）、半致死鹽度（ST50）以及耐高鹽馴化試驗對9種羅非魚進行了耐高鹽能力比較分析，結果表明，薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron）在MST、ST50、耐高鹽能力以及馴化期間的耐高鹽能力均高于其他羅非魚品種，可作為今后培育耐高鹽能力強的羅非魚的試驗材料[24]。

2 蝦類抗逆育種研究進展

2.1 抗病育種

目前，全球對蝦類影響最為嚴重的是白斑綜合征病毒（WSSV），因此亟需培育抗WSSV病的新品種。Mallik等采用斑節對蝦（Penaeus monodon）的71 bp微衛星和457 bp RAPD-SCAR DNA標記研究抗WSSV病流行率，定性PCR表明，WSSV流行率在季風前是最低的（0%），而在季風季節后是最高的（21.2%），定量PCR顯示，在季風季節后WSSV的平均拷貝數也最高，使用單一遺傳模式不能鑒定性狀，需結合環境影響[25]，該項研究為培育抗病斑節對蝦提供了參考;黃永春等從2002年開始通過選擇育種在引進的無特定病原的凡納濱對蝦（Litopenaeus vanname）親蝦子代中挑選生長性狀良好的個體作為親本建立第1代家系，之后再從第1代中挑選抗病能力強、生長快的個體建立第2代家系，然后進行抗WSSV侵染試驗，結果表明，第2代選育家系的對蝦抗病能力顯著高于第1代（P<0.05），但抗病能力強的家系對應的生長速度相對較慢，因此提出采用30%生長+70%抗病的綜合選擇進行選擇育種的方法[26]。1997年，李健等在黃海海域捕捉親蝦培育F1，經連續6代的群體選育培育出的中國對蝦（Penaeea chinensis）新品種“黃海一號”抗病能力明顯高于未選育群體[27]。2009年，孔杰等利用不平衡巢式交配設計，建立對蝦育種基礎群體，通過群體選育、家系選育以及多性狀復合育種等技術選育4代獲得新品種“黃海二號”，經對比試驗表明，比山東、河北育苗場養殖的中國對蝦存活率提高了5.35%[28]。Wu等利用高分辨率熔解曲線分析（high resolution melting，HRM）技術從新品種黃海2號中篩選出了WSSV抗性分子標記，再用WSSV人工感染，收集WSSV易感和抗性群體，經對比研究獲得了39個與WSSV抗性相關的SNP基因位點，為后續研究提供了參考[29]。

2.2 耐高溫和耐低溫育種

蝦類屬變溫動物，受水溫的影響比較大，溫度的大幅度變化會直接影響其生理和生化功能，導致抗病能力下降，死亡率增高，因此培育耐高溫和耐低溫性狀的優良品種具有很大的現實意義。通過雜交可獲得耐高溫和耐低溫性狀良好的品系，如胡志國通過引進凡納濱對蝦美國夏威夷SIS群體（UH）、美國邁阿密SIS群體（UM）和泰國正大群體（TZ）進行雜交得到9個F1代家系，進行對比研究發現，UH和UM雜交組合耐高溫能力最強，TZ和UH雜交組合耐低溫能力最強，為今后培育耐高溫及耐低溫對蝦品系提供了材料[30]。2017年，李東宇等通過比較南美白對蝦選育群體（SP）和雜交群體（HP）在低溫條件下的生長性能，得出HP在各個性狀上都極顯著優于SP（P<0.01），表明雜交群體的耐低溫能力高于選育群體[31]。隨著生物技術的不斷發展，通過篩選與耐低溫性狀相關的分子標記進行選育的研究越來越多，例如Meng等以中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）幼蝦的低溫應激組（4 ℃）和正常溫度組（18 ℃）為試驗材料，通過差異基因表達分析篩選、GO和KEGG富集分析，獲得了可能與低溫性狀相關的8個基因（C型凝集素、γ-丁基甜菜堿羥化酶、熱休克蛋白HSP70等）[32]，此研究結果為揭示中國明對蝦的分子機制及低溫脅迫下中國明對蝦分子輔助育種提供了基礎數據。

2.3 耐低鹽育種

斑節對蝦屬于廣鹽性生物，滲透壓調節能力較強，但過低的鹽度也會影響其代謝能力[33]。2016年，Chen等通過鹽度脅迫試驗比較8個品系斑節對蝦的耐低鹽能力，結果表明B家系對低鹽的耐受能力最強，不同家系對鹽度耐受程度都不同[34]，為以后選擇育種提供了參考。2017年，陳勁松等將泰國品系、非洲品系以及印尼品系的斑節對蝦進行雜交，建立了11個家系，并對其不同家系幼蝦的耐低鹽能力進行了對比，得出有4個家系的耐低鹽能力較強，可作為培育耐低鹽品系的基礎群體[35]。

2.4 其他抗逆性狀育種

養殖環境的溶氧量及氨氮濃度等非生物因子對蝦類的存活率影響也較大，李健等以子蝦Ⅰ期的耐氨氮脅迫的成活率為指標采用群體選育的方法經過5代選育，培育出中國對蝦新品種黃海3號，其成活率高且遺傳穩定，具有很強的耐氨氮脅迫能力[36]。邱立國等通過逆境脅迫法、酶性測定方法對不同家系MⅢ期凡納濱對蝦進行氨氮脅迫和低氧脅迫比較研究，得出6203家系的耐氨氮脅迫能力和耐低氧能力最強，各家系對氨氮和低氧的脅迫耐受力呈正相關[37]，對今后培育抗逆新品系具有重要意義。2018年，單保黨等對長期進行人工選育的南美白對蝦利洋一號及通過基因選育技術篩選的利洋二號進行了耐低氧比較研究，試驗發現利洋二號的平均耗氧量低于利洋一號，證明利洋二號的耐低氧能力較強[38]。蔣湘等在對日本囊對蝦耐氨氮的遺傳參數估計中發現耐氨氮為低遺傳力性狀，因此進行選育時采用家系選育效果會比較明顯[39]。

3 貝類的抗逆育種研究進展

3.1 抗病育種

國外對貝類抗病育種研究較多，其中雜交育種是培育優良新品種的常用方法，Frank-Lawale等在美洲牡蠣（Crassostrea virginica）的抗病雜交育種研究中發現，基因型和環境的相互作用是由疾病和鹽度共同驅動的，因此提出了采用鹽度育種策略來選育在合適鹽度范圍內的抗病品系[40]。Liang等在鮑抗菌性研究中利用雜交育種技術將皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）和盤鮑（Haliotis discus discus）進行雜交得出的雜交種在抗病能力方面表現出優于親本一方或兩方的雜種優勢，其免疫系統功能更強大，可有效抵制細菌的入侵[41]。此外，櫛孔扇貝（Chlamys farrei）和蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）[42]、皺紋盤鮑和盤鮑[43]、巖牡蠣（Crassostrea nippona）和長牡蠣（Crassostrea gigas）[44]等也進行了雜交育種并得到較好的育種效果。分子標記輔助育種技術在育種方面的應用越來越廣泛，為育種研究注入了新的活力。Guo等在縊蟶（Sinonovacula constricta）i型溶菌酶基因ScLYZ-2序列的研究中，得出的重組ScLYZ-2對副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）具有很強的抗菌活性[45]，為以后抗病育種提供了一定參考;Jiang等對文蛤（Meretrix petechialis）不同家系進行弧菌侵染試驗，結果顯示，不同家系對弧菌的抗性存在顯著差異（P<0.05），選擇3個抗性家系和3個易感家系用于篩選抗性相關標志基因，得出BIRC7、Big-Def、CTL9、NFIL3和Bax的表達水平與抗弧菌表型相關，可以被認為是候選抗性相關標志物[46]。

3.2 耐高溫和耐低溫育種

貝類的生理功能、生長發育及存活率受水體溫度的直接影響。王金鵬利用長牡蠣和福建牡蠣（Crassostrea angulata）進行雜交構建家系，經人工高溫刺激（37 ℃），得到高溫敏感群體和高溫耐受群體，通過極端表型混池重測序的方法篩選2個群體中的SNP位點，研究發現了95個與耐高溫性狀相關的SNP位點和48個候選基因，本試驗還通過構建牡蠣的高密度遺傳連鎖圖譜，對熱刺激下15個HSP70和HSP20的高表達量基因進行了eQTL定位研究，采用熒光定量PCR測量基因表達量，篩選出3個基因并對其進行eQTL定位，最終在QTL位點中定位到20個候選基因，表明SNP位點可能通過調控HSP基因表達量的變化進而影響牡蠣的高溫耐受能力[47]。Meng等研究了溫度變化時合浦珠母貝（Pinctada fucata）家系（海水珍珠牡蠣）中類胡蘿卜素含量對其免疫能力的影響，結果表明，當溫度升高，合浦珠母貝的存活率（SR）從26 ℃到34 ℃逐漸下降，總類胡蘿卜素含量（TCC）降低;當TCC較高時，SR也較高[48]。但周童在研究高溫脅迫時類胡蘿卜素對熱休克蛋白HSP22基因表達的影響中發現，并不是類胡蘿卜素高的組HSP22表達量都高于類胡蘿卜素低的組，高溫脅迫時，類胡蘿卜素含量不是單一影響HSP22表達量變化的因素[49]，類胡蘿卜素和HSP22的相互作用有待進一步探究，但類胡蘿卜素的含量可以作為一個指標進行選擇育種。

3.3 耐低氧育種

貝類一般具備很強的耐低氧能力，如4～5.5 ℃時長牡蠣在缺氧狀態下可以存活近2周;27～28 ℃時紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）稚貝在 1.42 mL/L 的溶氧環境中還可以進行正常的生理代謝[50]。國內外對于貝類耐低氧育種的研究較少，近2年貝類出口貿易逐漸增多，為保證貝類抵抗活體運輸的壓力，一些研究工作者開始著手耐低氧的研究。2018年，Powell等測試了選育紫貽貝家系的2個關鍵表型反應（厭氧酶活性和殼鞘行為），得出貽貝越早轉換為無氧代謝對低氧的耐受性越強，最初貽貝殼鞘閉合時間越長其耐受性和耐侵入性越強[51]，2種表型反應為貽貝耐低氧選擇育種提供了參考。王化敏等用1 mg/L的氧氣濃度對4種殼色的蛤仔進行脅迫試驗，對比其在低氧脅迫下熱休克蛋白家族和抗氧化酶家族基因成員的表達量，研究結果表明，斑馬蛤熱休克蛋白TPx基因以及白蛤的TPX和抗氧化酶HSP40基因在低氧脅迫時的表達量顯著高于其他品系（P<0.05），其中斑馬蛤及白蛤熱休克蛋白TPx基因參與體色的表達[52]，初步證實了有關色素合成的一些基因會在低氧脅迫過程中發揮作用，為以后通過殼色選擇育種耐低氧品系提供了依據。

3.4 耐鹽性育種

對于貝類來說其耐鹽性與生活的水域環境有很大的關系，生活在環境相對穩定的水域的貝類對鹽度的耐受能力相對較低（如鮑、大珠母貝等），反之則較高[50]。蔣湘等通過人工授精的方式將九孔鮑（Haliotis diversicolor supertexte）1雄配3雌進行交配，建立家系進行了低鹽脅迫試驗，結果表明，耐低鹽性狀遺傳力較低，可采用家系選育，后續對耐低鹽脅迫性狀選育時則需要更多的家系[53]。丁鑒鋒等發現殼色與低鹽耐受性有一定的相關性，在對3種殼色的菲律賓蛤仔進行耐低鹽能力對比研究中得出斑馬蛤的死亡率最低[54]。She等用太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的耐低鹽群體、耐高鹽群體和對照群體進行GWAS研究、HRM和mRNA表達分析，篩選出24個基因包括氯離子通道蛋白（Cg_CLCN7）、細胞凋亡抑制劑（Cg_AP1）等，主要參與離子/水通道的轉運機制、游離氨基酸和活性氧代謝、免疫反應和化學防御，位于這2個基因上的3個SNP在群體間顯著不同，表明這些基因可能在牡蠣的耐低鹽和耐高鹽性能中起重要作用[55]，這不僅使我們進一步了解了貝類對鹽度的適應機制，而且為培育耐低鹽和耐高鹽牡蠣品系提供標記和科學依據。

4 展望

水產動物抗病育種是水產動物抗逆育種中研究最多的領域，目前對水產動物疾病的研究主要集中在細菌和病毒方面，抗病育種一般采用家系選育和分子標記輔助育種相結合的方法開展。連續多代家系選育可直接得到抗病能力強的品系，具有操作簡單、效果好、避免近親交配、減緩遺傳衰退的優點，但家系選育對空間需求大、世代間隔時間長[55]。分子標記輔助抗病育種則具備精準、高效、不受環境條件影響的優點，通過篩選與抗病相關的DNA分子標記，根據分子標記將與抗病性狀相關的基因進行富集，再結合常規育種技術建立優良種群，理論上能夠取得比較好的效果，但目前大部分利用分子標記輔助育種的效果沒有明顯優于傳統育種主要是因為一方面性狀不是由單一基因控制的，篩選的標記相關基因可能無法控制整個性狀;另一方面群體之間共享的主效分子標記較少，在一定程度上限制了其應用與發展;最后，育種的家系少或群體比較小，分子標記篩選需要大量的家系或群體來保障多樣性，從而保證標記的廣泛適用性[56]。

有關水產動物其他抗逆性狀的育種方面，選擇育種、雜交育種和分子標記輔助育種運用的都比較廣泛。雜交育種一直是選育良種的常用辦法，耐鹽性、耐低溫、耐高溫、耐低氧等均屬于數量性狀，是由眾多微效基因控制的，選擇具有優良性狀的親本進行雜交可以使其基因重新分配組合，將控制同一目標性狀的不同微效基因累積起來，從而使子代在該性狀上超過親本出現雜種優勢，但此方法耗時長、過程復雜且會出現性狀分離。由于產業對水產動物耐鹽性、耐低溫、耐高溫、耐低氧等性狀的要求不是特別急切，因此對這些抗逆性狀的研究相對較少。對今后抗逆育種的研究，可以采用常規育種技術與全基因組輔助選擇相結合的方法進行，首先利用常規育種手段進行表型選擇得到優良的抗逆性狀，然后通過全基因組輔助育種手段獲得所有與抗逆性狀相關的標記位點，再通過軟件找到最佳組合，從而快速培育出抗逆性強的水產新品種。雖然目前全基因組輔助選擇育種技術還處于研究的初級階段，但隨著測序成本的不斷下降和育種技術的不斷創新，水產動物的抗逆育種研究在不久的將來能夠取得較大的突破。

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