蜂毒前溶血肽原基因的改造及其原核表達

摘要：為進一步探討利用基因工程技術生產蜂毒肽的方法，根據大腸桿菌密碼子偏好性、基因GC含量、合成蛋白加工需求等對蜂毒前溶血肽原基因序列進行改造，并利用人工化學合成方法完成改造后全基因的合成。構建蜂毒前溶血肽原與GST融合表達重組質粒pGEX-4T-1/PPMel，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞后分別在20、37 ℃條件下經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達，并利用SDS-PAGE和Western Blot對產物進行檢測。結果表明，表達體系成功表達了目的融合蛋白，在20 ℃條件下可獲得可溶性表達產物，為進一步分離純化目的蛋白及獲得蜂毒肽提供了基礎。

關鍵詞：蜂毒前溶血肽原;蜂毒肽;原核表達;融合蛋白

中圖分類號：Q789

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0087-04

蜂毒肽（melittin）又稱蜂毒溶血肽，是蜂毒（bee venom）的主要活性成分之一[1]，在抗菌[2-3]、消炎[4]、抗腫瘤[5-6]乃至肌肉再生[7]等方面具有一定應用價值。目前基因工程技術為蜂毒肽生產提供了新的途徑[8-9]，但從研究到生產仍有一定距離。

蜂毒前溶血肽原（melittin precursor/Prepromelittin）是prepromelittin基因的表達產物，在蜜蜂體內合成后首先加工成蜂毒溶血肽原（蜂毒肽前體蛋白，promelittin），這是蜂毒肽的前體形式，可被進一步水解而形成蜂毒肽[10]。蜂毒前溶血肽原由70個氨基酸殘基構成，其結構主要包括信號肽（1～21 aa，aa為氨基酸個數的縮寫）、低復雜性區域（22～43 aa）和蜂毒肽結構域（44～69 aa）[11]。與蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，且對細胞的破壞能力小[12]，可以考慮作為利用基因工程方法在體外合成蜂毒肽的初始產物。

本研究通過全基因合成的方法合成了改造后的蜂毒前溶血肽原基因，構建了蜂毒前溶血肽原與谷胱甘肽S轉移酶（glutathione S-transferase，GST）融合表達重組質粒，并在大腸桿菌BL21感受態細胞中誘導表達，獲得了目的融合蛋白，為利用基因工程方法生產蜂毒肽提供了一定依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

表達載體pGEX-4T-1、大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10感受態細胞、大腸桿菌BL21感受態細胞及Pfu DNA聚合酶、緩沖液A（PBS，pH值7.4）、緩沖液B[8 mol/L尿素（urea）、50 mmol/L Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷與鹽酸配成的常用緩沖劑）、300 mmol/L 氯化鈉，pH值8.0]、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、蛋白Marker、TMB顯色試劑盒、Western Blot一抗、Western Blot二抗等分子生物學試劑均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因改造、合成及擴增 蜂毒前溶血肽原基因序列信息來自NCBI GeneBank數據庫（登錄號：NM_001011607），選擇其CDS序列，根據大腸桿菌密碼子偏好并考慮其序列GC含量、酶切位點等信息對蜂毒前溶血肽原基因進行改造。利用CondonW等軟件對改造后的序列最優密碼子使用頻率、GC含量（DNA的4種堿基中，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率）等進行分析[13]。

根據改造后的基因序列，利用人工化學合成方法進行全基因合成，設計并合成引物對合成基因進行PCR擴增，所用引物序列如圖1所示。上游引物中引入EcoRⅠ酶切位點，下游引物中引入SalⅠ酶切位點。基因及引物合成工作委托生工生物工程

（上海）股份有限公司完成。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后利用DNA純化試劑盒回收目的片段。

1.2.2 重組質粒的構建 利用限制性內切酶Eco RⅠ和Sal Ⅰ對回收的PCR產物及pGEX-4T-1載體進行雙酶切，回收酶切后的目的片段及載體。利用T4 DNA連接酶將酶切后獲得的目的片段與載體進行連接，獲得蜂毒前溶血肽原與GST融合表達重組質粒pGEX-4T-1/PPMel。重組質粒轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，經含有50 μg/mL氨芐青霉素的平板培養過夜后，篩選陽性克隆進行酶切鑒定并由生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

1.2.3 蛋白表達 重組質粒pGEX-4T-1/PPMel轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，42 ℃熱激90 s后涂布到含有50 μg/mL氨芐青霉素的平板上，37 ℃培養過夜。挑取單克隆到含有50 μg/mL氨芐青霉素的液體培養基中振蕩培養。當菌液D600 nm值達到0.6時，加入0.5 mmol/L的誘導劑（IPTG），分別置于20 ℃條件下培養過夜、37 ℃條件下培養6 h，以未添加誘導劑的菌液為陰性對照。

菌液經離心后棄上清，收集菌體。在收集到的菌體中加入緩沖液A懸浮，使用超聲破碎儀使其充分溶解，離心，分別收集上清和沉淀。收集的沉淀使用緩沖液B進行溶解。分別對收集的上清和沉淀溶解液處理后制備樣本，利用SDS-PAGE和Western Blot進行檢測。

2 結果與分析

2.1 優化后的基因序列信息

改造后的DNA序列長度為213 bp，在蜂毒肽對應的核酸序列前加入1個密碼子AAC，使其表達Asn，從而形成Asn-Gly位點，用于通過羥胺裂解獲得蜂毒肽[8]。根據生物信息學分析可知，蜂毒前溶血肽原基因的表達產物末端氨基酸殘基為Gly，而蜂毒肽末端缺少Gly，故在改造后的序列中刪除了其對應的密碼子GGT（圖2），保證了表達產物被酶切割后的蜂毒肽產物長度為26個氨基酸。改造后的序列中，大腸桿菌最優密碼子使用頻率多在90%以上（占85%）（圖3），其GC含量為50.2%，且無異常GC峰。其序列中無一般順式作用元件（Cis-acting elements）序列。

2.2 重組質粒的酶切檢測

根據電泳結果可知，重組質粒的酶切產物主要是約5 000 bp和200 bp的2個片段（圖4）。其中大片段為載體質粒，小片段為插入的基因片段。插入片段的測序結果與預定改造后的蜂毒前溶血肽原DNA序列一致（圖2），且能與pGEX-4T-1載體中的GST基因序列形成正確的讀碼框。重組質粒圖譜如圖5所示。

2.3 蛋白表達檢測

含有重組質粒pGEX-4T-1/PPMel的工程菌在20 ℃和37 ℃條件下進行IPTG誘導培養后，SDS-PAGE檢測結果顯示，2個溫度條件下的產物在約35 ku處均有特異性蛋白條帶出現，大小與預期融合蛋白大小符合（圖6），由GST和蜂毒前溶血肽原構成。為進一步確定目的蛋白的表達情況，按照Western Blot步驟用TMB顯色試劑盒顯色。結果顯示，在相應位置出現明顯條帶（圖7），進一步表明目的蛋白已成功表達。但在37 ℃培養條件下，目的蛋白主要出現在沉淀中，表明表達產物主要為包涵體形式存在。而在20 ℃條件下，上清液和沉淀中均出現了表達產物，說明此溫度下表達產物一部分以可溶性蛋白的形式存在，一部分以包涵體形式存在。

3 討論與結論

利用人工化學合成技術獲得全基因序列為基因的改造提供了方便。這種方法既可以縮短合成周期，又為序列的正確性提供了保障。同時，在進行原核表達時，可以有效地根據原核生物密碼子偏好性及其他需要對目的片段的基因序列進行優化及定點突變，密碼子的優化將有利于目的基因在宿主細胞內高效精確地表達。蜂毒前溶血肽原基因CDS序列全長僅213 bp，可以按一定原則對其進行充分改造，再利用上述方法將其合成，使之滿足在不同細胞內表達的需要。對基因序列進行改造過程中考慮到應用羥胺裂解方法對GST-蜂毒前溶血肽原融合蛋白進行處理以獲得蜂毒肽，所以在原序列上添加了相應氨基酸對應的密碼子（AAC），使表達產物中蜂毒肽結構域前形成羥胺裂解位點（Asn-Gly）。若考慮通過其他酶或化學物質從表達產物上將蜂毒肽切割下來，可以設計其他相應密碼子，如利用腸激酶作用位點時[9]，可在蜂毒前溶血肽原基因中蜂毒肽對應的序列首密碼子前添加GAC GAC GAC GAC AAG序列。已知多種酶或化學試劑在蜂毒前溶血肽原上沒有切割位點或在蜂毒肽結構域沒有切割位點，可以按照此思路在蜂毒肽前溶血肽原基因中相應位置添加對應的密碼子序列[8]。

利用基因工程技術生產蜂毒肽被看作是獲得蜂毒肽的新途徑，研究者關注蜂毒肽對細胞的毒性，探索利用融合蛋白等方式實現蜂毒肽在原核細胞、真核細胞中的表達。考慮到蜂毒肽在蜜蜂體內以其前體蛋白蜂毒前溶血肽原的形式表達，筆者設計了蜂毒前溶血蛋白原的全基因序列，期望以此降低其對細胞的破壞作用。為了便于從表達產物中分離目的蛋白，選擇了利用GST融合蛋白的形式進行表達。構建的蜂毒前溶血肽原與GST融合表達重組質粒pGEX-4T-1/PPMel能夠在不同溫度下進行表達，其在20 ℃條件下表達的目的蛋白一部分以可溶性蛋白的形式存在，為進一步分離純化表達產物并進行切割以獲得有活性的目的蛋白提供的方便。但由于GST標簽自身相對分子質量較大，而設計的目的蛋白又非常小，對相關下游試驗可能會有較大影響。考慮到設計的目的蛋白蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，對細胞膜的破壞能力較低，也可以嘗試使用分子量較小的His標簽。蜂毒前溶血肽原本身具有信號肽結構，若有好的無標簽分離純化目的蛋白的方法，也可以嘗試直接表達蜂毒前溶血肽原。而有關其表達量的提高及表達產物的處理等仍需進一步研究。

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