1例冠狀病毒、大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌引起的犢牛腹瀉

王海燕 管遠紅 蔡丙嚴 郭廣富 陳長春

摘要：犢牛腹瀉對養牛業造成了極大威脅和損失，其病因復雜，以傳染性病原體的威脅最大。2017年2—3月，江蘇某奶牛場的50多頭新生乳犢牛陸續出現腹瀉，發病率達到30%，用多種藥物治療后無效，犢牛的病死率達到100%。為了解其病因，筆者對病死犢牛進行了剖檢，無菌采集腸系膜淋巴結、脾臟等進行細菌分離，并取腹腔滲出液、腸道內容物進行處理和電鏡觀察。結果表明，從病樣中分離鑒定得到大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌，通過對處理的病料進行電鏡觀察，發現了大量冠狀病毒樣顆粒;應用逆轉錄PCR（RT-PCR）擴增冠狀病毒N蛋白基因部分片段，得到特異性目的片段大小的產物。使用頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、阿莫西林、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、大觀霄素、四環素、氯霉素、利福平、呋喃唑酮等藥物對分離菌進行耐藥性試驗，結果顯示，分離菌對供試藥物大多表現為耐藥，僅對頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉等表現為中度敏感。由研究結果可以看出，江蘇某奶牛場的病例是由冠狀病毒與2種細菌的混合感染所致，抗生素治療效果不好，由于存在混合感染，消毒和預防措施顯得更為重要。

關鍵詞：冠狀病毒;大腸桿菌;肺炎克雷伯氏菌;犢牛;腹瀉;病原學

中圖分類號：S858.237.3+4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0201-04

犢牛腹瀉是牛場生產過程中犢牛面臨的最主要的健康問題之一，是犢牛死亡的最常見的原因[1]。犢牛腹瀉是指新生10日齡左右的犢牛發生的一種以消化不良、腹瀉為主要癥狀的胃腸消化道疾病[2-4]，該病一年四季均可發生，尤其在初春、夏末、秋初氣候多變的季節多發，發病率高，哺乳期的犢牛更容易發生腹瀉，在世界范圍內，奶牛場犢牛腹瀉發病率為20%～100%[5-10]。腹瀉往往是多種疾病的一種臨床表現，犢牛腹瀉的原因很多，包括犢牛本身的因素以及所處的環境、營養與傳染性因子等多種因素[1，11]。因此，以上原因造成發病犢牛在臨床上的表現各異，但是主要癥狀表現為腹瀉，在犢牛發病初期，犢牛往往排稀軟、水樣糞便;隨著病程的發展，犢?？赡鼙憩F出脫水的癥狀，如眼窩下陷、黏膜干燥、被毛焦燥等;隨著脫水癥狀的加重，患病犢牛可能表現出末梢發涼、食欲減退或廢絕、喜臥或難以站立、昏迷等癥狀[1-2]。腹瀉會造成新生犢牛死亡和發育不良，從而引起巨大經濟損失，是牛場需要重點防控的疫病[1，12-13]。

2017年初江蘇某奶牛場產犢牛50多頭，新生犢牛陸續出現腹瀉，用多種藥物治療后均無明顯效果。筆者對死亡犢牛進行剖檢和病原學研究。

1 病例情況與病死犢牛剖檢情況

某奶牛場存欄500頭左右，奶產量較高，每頭產奶牛平均每天產奶34 kg左右，2017年2月開始陸續產犢，初期吃初乳基本沒有問題，換常奶后發病。換常奶期間母牛飼料及飼養管理與以前相比沒有任何變化。出現腹瀉后，犢牛后軀被稀糞污染，使用拜有利、青霉素、百痢克等藥物（按廠家推薦劑量使用）進行治療，對于體溫高的犢牛注射安乃近后，效果不佳，然后使用恩諾沙星、氟苯尼考等藥物（按廠家推薦劑量使用），效果仍不佳，最后增加使用中藥（白頭翁、黃連、黃柏、陳皮等），仍然不見好轉。一般病程為2～3周，發病率約30%，病死率為100%。

病死犢牛剖檢情況如下：主要見極度消瘦，嚴重脫水，體表被糞便污染（圖1）;齒齦出血、潰瘍;胸腔、腹腔、心包積液（圖2）;全身淋巴結腫大，出血（圖3）;腸道空虛（圖4），胃底出血。

無菌采集病死犢牛脾臟、肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結等臟器放入無菌收集袋中;將胸腔、腹腔滲出液等放入高壓處理的指形管中保存。

2 實驗室病原學檢查

2.1 病毒學檢測

對采集的病死牛的臟器和滲出液等進行處理和檢測。

2.1.1 電鏡觀察 將采集的病死犢牛胸腔、腹腔滲出液經離心、濃縮處理后進行負染，隨后在揚州大學測試中心電鏡室進行電鏡觀察。

2.1.2 分子生物學檢測 通過逆轉錄PCR（RT-PCR）擴增牛冠狀病毒N蛋白編碼基因，上游引物序列為5′-CGATCAGTCCGACCAATCTA-3′，下游引物序列為5′-GAGGTAGGGGTTCTGTTGGG-3′[14-15]，預期擴增的N基因產物片段大小為 597 bp。用TRIzol試劑提取病死犢牛腸道內容物病毒總RNA用于反轉錄，具體參照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行。采用20 μL擴增體系，其組成如下：1 μL cDNA，10 μL 2×PCR Mix，各0.5 μL上、下游引物，8 μL超純水。反應條件如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35個循環;72 ℃ 10 min。隨后電泳觀察擴增結果。

2.2 細菌的分離和鑒定

分別取病死犢牛脾臟、腸系膜淋巴結、肝臟并無菌接種于血瓊脂平板上，同時進行有氧和厭氧培養，于37 ℃培養18 h左右，觀察是否有菌落生成，若有，則進行多次傳代純化，最終記錄菌落結果。

2.2.1 染色鏡檢 對純化得到的菌株進行革蘭氏染色、鏡檢。

2.2.2 生化試驗 利用細菌微量生化反應管（購自杭州微生物試劑有限公司）對分離所得菌株進行生化指標的測定，操作方法與判定標準參照說明書。在37 ℃條件下培養24 h后，與對照管比對，觀察反應結果并記錄。

2.2.3 16S rDNA基因的擴增與測序、分析 挑取4個典型菌落提取基因組DNA，利用煮沸法煮沸 10～15 min后離心、取上清，備用。PCR參照寶生物工程（大連）有限公司的TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR kit說明書進行，采用25 μL擴增體系，含有2 μL DNA模板，12.5 μL PCR Mix，各0.25 μL上、下游引物，10 μL 超純水。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，53 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸5 min。將PCR產物經電泳后觀察結果，再將PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。對測定的DNA序列進行BLAST比對，根據同源性高低確定細菌的種屬。

2.3 藥物敏感性試驗

使用頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、阿莫西林、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、大觀霄素、四環素、氯霉素、利福平、呋喃唑酮等藥物紙片對分離得到的細菌進行藥物敏感性試驗。

3 結果與分析

3.1 病毒學檢測結果

由圖5可以看出，負染鏡檢可見大量冠狀病毒樣顆粒，完整的病毒粒子直徑為120～130 nm，花冠狀的病毒纖突清晰可見。

由圖6可以看出，從樣本中擴增出了與牛冠狀病毒N蛋白編碼基因預期大小一致的核酸條帶。

3.2 細菌分離結果和菌落形態

于37 ℃培養18 h后，在有氧培養和厭氧培養的血瓊脂平板上均長出了菌落，未見溶血，其中有氧培養的菌落相對厭氧培養的稍大;肉眼觀察發現，在有氧和厭氧培養的菌落特征中，除大小外無其他差異。進一步純化發現，有氧培養的菌落中的一種較大，呈凸起、不透明、灰白狀，邊緣整齊，且邊緣由于遮光性和水分而似透明狀;另一種菌落稍小一些，呈稍凸起、不透明、灰白狀，邊緣整齊。

染色后的鏡檢結果表明，有氧和厭氧培養的細菌間無明顯差異。染色鏡檢結果顯示，有氧和厭氧培養的細菌均為粗短直桿菌，革蘭氏染色結果呈陰性。16S rRNA基因測序結果表明，分離菌分別為肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌。此外，生化發酵管試驗結果也驗證了這2種分離菌的生化特征。

3.3 藥物敏感性試驗結果

用頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、阿莫西林、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、大觀霄素、四環素、氯霉素、利福平、呋喃唑酮等藥敏紙片進行藥敏試驗的結果表明，分離菌對很多藥物耐藥，對頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉的敏感性稍強，對大多數藥物完全耐藥。

4 結論和討論

犢牛發生腹瀉主要由飼養管理不當、應激、細菌、病毒及寄生蟲等方面的原因引起[1]。細菌中的大腸桿菌[16-18]、沙門氏菌[19]、彎曲桿菌、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌[1，20-24]，病毒中的輪狀病毒[25-28]、冠狀病毒[14-15]、星形病毒、微病毒，寄生蟲中的隱孢子蟲等均可造成該病的傳播和流行[1，29-30]。近年來，混合感染的報道越來越多，王丹陽等曾報道了牛病毒性腹瀉病毒、大腸桿菌和奇異變形桿菌混合感染引起的犢牛腹瀉[31];吳城等對福建省牛流行性腹瀉病毒和牛輪狀病毒混合感染進行了調查[32]。此外，還有一些研究針對細菌性或病毒性的多種感染進行了調查報道[29-30]。本研究中的病例是由冠狀病毒、大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染引起的，這也是首次報告。目前，多種病原體造成混合感染的病例越來越多，需要引起相關人員的重視。群體中的疾病發生時，各種復雜因素綜合作用會造成臨床表現復雜，剖檢病變也很復雜，此外，由于混合感染的病例越來越多，根據病史、臨床癥狀也很難作出診斷。疾病的確診必須依據腸道微生物、患犢糞便的檢查，甚至須要進行病原學、分子生物學檢查或動物試驗[1]。由于各種方法本身的限制性及臨床經驗的差異，檢測本身可能也存在漏檢問題，也因此造成臨床用藥效果不佳。隨著藥的種類越來越多，量也可能越來越大，從而產生耐藥性，這樣就會形成惡性循環，因此，確診就顯得非常重要，篩檢的項目也須要增加。在本試驗剖檢結果中出現了很多與腹瀉無關的病變，可能是由病程長、施用多種干預措施與繼發感染等導致的。所以，很多剖檢變化不能作為指征性的病變，在這類疾病的診斷過程中要注意相關問題。

在本試驗中檢測出了3種病原體，其中1種是冠狀病毒，該病毒雖然不是造成犢牛腹瀉的主要病原體，但是在本例的腸道和滲出物中出現了大量病毒顆粒，說明該病原體在致病過程中起到重要作用。而在淋巴結和多種臟器中均分離到了2種細菌病原體（大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌），說明它們在致病過程中也有一定作用，但是由于各種因素的制約，很難對其致病性進行明確。

大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌均屬于腸道桿菌，很多生物學特性相似，在區分時并不是非常明顯，從而給診斷帶來了一定困難，有時候甚至會出現漏診。此外，在本試驗中發現菌落稍有差異，因此在進行16SrRNA基因測序時選擇幾個不同的單個菌落進行測定才發現有2種菌落，進而進行回顧性菌落鑒定，差點造成誤診。2種細菌的耐藥譜廣、耐藥性強，與臨床上用藥效果不佳有一定關系。在本試驗的治療過程中雖然也使用了中藥，但是由于中藥以調理為主，因此在這種急性病例中的效果不明顯。

在我國，種牛、冷凍精液的引進給我國的奶牛養殖帶來了一定風險，雖然大多數養殖場都是從正規企業購進種牛的，但是多種病原體的間歇性帶毒問題給檢測工作帶來了一定難度，再加上由于成本的增加，由非正規途徑獲得的冷凍精液的風險更高，例如很多西方國家牛場的牛病毒性腹瀉非常嚴重。因此，規范引種、引進冷凍精液或胚胎至關重要[1-2]。加強生物安全是該病防控的重點[32-34]，但是生物安全是一系列工作的集成，一旦某個環節出現問題，將造成巨大經濟損失[35]。奶牛場的管理者和獸醫在平時工作中應對各種生物安全措施進行風險評估，查漏補缺，抓重點措施和影響較大的措施，這樣即使出現問題，也是小的問題，從而將損失降到最低。

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