對豬小腔卵泡孤雌激活胚胎發育力的初步探索

宋尚橋 馬圍圍 曾素先 嚴瑾 孫翠翠 李鑫 黎宗強

摘要：為探討直徑為2 mm以下和2～6 mm豬卵泡卵母細胞的體外培養分裂率與囊胚率差異，采用相同體外成熟培養條件，來培養從不同直徑的2種卵泡中所抽出的卵母細胞，在卵母細胞成熟培養后44～48 h，對卵母細胞進行化學激活和體外培養，觀察胚胎體外發育能力;在培養48 h時進行分裂數據統計，培養168 h時統計囊胚個數。結果發現，2 mm 以下豬卵泡卵母細胞孤雌激活后胚胎的體外培養平均分裂率與2～6 mm豬卵泡卵母細胞孤雌激活后胚胎的體外培養平均分裂率差異顯著，分別為62.46%、81.76%（P<0.05）;2 mm以下豬卵泡卵母細胞孤雌激活后胚胎的體外培養平均囊胚率與2～6 mm豬卵泡卵母細胞孤雌激活后胚胎的體外培養平均囊胚率差異不顯著，分別為11.71%、15.30%。說明正常卵泡、小腔卵泡的卵母細胞在體外成熟后，孤雌激活胚分裂率依次降低，孤雌胚胎的分裂能力隨卵泡直徑的增大而增強;正常卵泡、小腔卵泡的卵母細胞體外成熟后，孤雌激活胚囊胚率隨卵泡直徑的增大有一定增高，但變化不顯著。

關鍵詞：豬;小腔卵泡;孤雌激活;分裂率;囊胚率

中圖分類號：S852.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0205-03

對于卵母細胞成熟體系、胚胎發育體系、胚胎干細胞體系的建立及體細胞核移植效率的提高仍需要依賴于各技術環節的進一步完善[1]，而孤雌激活胚胎的準備是其中不可或缺的一個環節，也是非常重要的影響因素之一[2]。因此，對于小腔卵泡孤雌激活胚胎發育率的研究顯得十分必要。在豬卵巢卵母細胞體外成熟、孤雌激活方面的研究，目前已取得關鍵性突破[3]。只有卵泡直徑達2 mm時，卵泡內的卵母細胞才具有體外成熟的能力[4]。卵巢上分布著許許多多的細胞，不僅包括少量的大腔卵泡卵母細胞，還包括數以萬計的腔前卵泡卵母細胞和小腔卵泡細胞，這些細胞是供給進行體外培養所需成熟卵母細胞的潛在重要支柱[5]。早在1996年，Tsafriri等在體外培養豬1～2 mm卵泡的卵母細胞，獲得15%～25%的成熟率[6]。本研究對豬小腔卵泡卵母細胞的體外成熟孤雌激活胚胎發育率進行探索，以期為豬的多種試驗研究提供寶貴材料，如體外受精試驗、核移植試驗等，為對卵母細胞在體外培養過程中發育機制的探索有重要價值和研究意義[7-8]。因此，直徑<2 mm的卵泡的卵母細胞體外成熟的孤雌激活發育能力及其機制將逐漸被揭示。通過對豬小腔卵母細胞孤雌激活后體外發育能力的研究，為解決豬卵巢資源緊張提供新的資源。

1 材料

1.1 試驗樣品的采集

從廣西大學附近的屠宰場獲得新鮮豬卵巢，將其放置于30～35 ℃裝有生理鹽水的保溫瓶中，在 1 h 內運回實驗室進行相關的試驗操作。

1.2 主要試劑

本研究所用化學試劑除特別指明外，均購自Sigma公司，如洗卵液（CCM）、胚胎培養液（NCSU）、體外成熟培養液（M）、離子霉素、2，6-二甲苯酚（6DMP）;促卵泡激素（FSH）和促黃體生成素（LH），購自中國科學院動物研究所;培養用儀器為TCM-199，購自Gibco公司;一次性塑料皿，購自NUNC公司。

2 方法

2.1 卵母細胞的收集

用帶針頭的注射器分別抽取卵巢表面上直徑<2 mm 和直徑為2～6 mm的卵泡的卵母細胞，并將2～6 mm卵泡的卵母細胞設為第1組，直徑<2 mm 卵泡的卵母細胞設為第2組。在實體顯微鏡下用玻璃吸管吸取帶2層卵丘細胞以上、胞質均勻的卵母細胞，之后以具有完整卵丘細胞層的標準篩選卵母細胞，將篩選得到的卵母細胞用CCM洗凈后，以30～60枚為1組移入含1.5 mL成熟培養液的玻璃平皿（30 mm×10 mm）中，設定體外成熟培養條件為：38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度。將不同組的卵母細胞作好標記分開成熟培養。

2.2 豬卵母細胞的孤雌激活

在豬卵母細胞體外成熟培養44～48 h后，向其中加入含0.1%透明質酸酶的洗卵液除去卵丘細胞，并用槍頭輕輕吹打。然后在40倍體視顯微鏡下檢查卵母細胞是否排出第一極體，以排出第一極體作為卵母細胞核成熟的標志。挑取核成熟卵母細胞，采用5 μmol/L離子霉素處理5 min后，用 2.5 mmol/L 二甲氨基嘌呤處理4 h，最后移至 100 μL/滴的胚胎培養基中置于培養箱中培養 168 h，并設定培養條件為：39 ℃、5% CO2飽和濕度。將不同組胚胎作好標記分開培養。

2.3 豬孤雌激活胚胎發育力數據統計

在胚胎培養48 h時，統計孤雌激活胚胎發育分裂率;在培養168 h時，統計孤雌激活胚胎發育囊胚率。所得試驗結果均用SPSS 11.0軟件進行統計分析，對計量資料進行t-檢驗分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 豬小腔卵泡與正常直徑卵泡卵母細胞孤雌激活胚胎分裂率

由表1可知，2 mm以下卵泡卵母細胞（小腔卵泡卵母細胞）孤雌激活后胚胎的體外培養平均分裂率與2～6 mm豬卵泡卵母細胞（正常卵泡卵母細胞）孤雌激活后胚胎的體外培養平均分裂率分別為62.46%、81.76%，二者差異顯著（P<0.05）。表明從不同直徑的卵泡中抽出的卵母細胞孤雌激活后，孤雌激活胚分裂率不同，孤雌胚胎的分裂能力隨卵泡直徑的增大而增強。

3.2 豬小腔卵泡與正常直徑卵泡卵母細胞孤雌激活胚胎囊胚率

由表1可知，2 mm以下卵泡卵母細胞孤雌激活后胚胎的體外培養平均囊胚率與2～6 mm豬卵泡卵母細胞孤雌激活后胚胎的體外培養平均囊胚率分別為11.71%、15.30%，二者差異不顯著（P>0.05）。表明從正常卵泡、小腔卵泡中抽出的卵母細胞孤雌激活后，孤雌激活胚囊胚率與卵泡直徑大小有一定的關系，囊胚率隨卵泡直徑的增大而增高，但正常卵泡與小腔卵泡所抽出的卵母細胞囊胚率相比，差異不顯著。

4 討論

進入20世紀90年代后，有更多學者投身于小腔卵泡的研究，豬小腔卵泡的體外成熟研究已經相當普遍，但體外成熟小腔卵泡的孤雌激活研究較少[9-10]。Tsafriri等對豬的1～2 mm卵泡卵母細胞進行體外培養，發現其成熟率達到15%～25%[11]。家畜小腔卵泡卵母細胞仍然需要經歷很多復雜多變的生理生化過程才能具有恢復和完成成熟分裂的能力。相關研究表明，豬卵母細胞的成熟率和卵泡直徑呈正比[12]。在體內正常生理條件下，卵母細胞發育程度與卵泡直徑呈正比。豬小腔卵泡卵母細胞正處于生長后期，進行活躍的RNA合成，其體外成熟能力低于2～6 mm卵泡的卵母細胞[13-14]。研究顯示，2 mm以下卵泡和2～6 mm卵泡的卵母細胞孤雌激活胚胎分裂率分別為52.63%、80.39%，二者有顯著差異[7]。

囊胚率是分析胚胎發育情況的一個指標[15]。直至目前，大多數的科學研究做豬卵母細胞孤雌激活試驗時，都熱衷于以胞質均勻、包裹多層卵丘細胞的卵母細胞為研究對象[16]。已有的相關研究表明，擴展的卵丘細胞可以通過調節物質的通透性，誘捕卵母細胞排出的有害物質，從而達到有效抑制卵母細胞死亡和退化的效果[17]。但從小腔卵泡中抽出的卵母細胞孤雌激活后的囊胚率卻很高，和 2～6 mm 卵泡的卵母細胞孤雌激活胚胎的囊胚率差異不顯著，表明卵泡大小對卵母細胞體外成熟、體外發育有重要影響。

5 結論

研究發現，正常卵泡、小腔卵泡的卵母細胞體外成熟后，孤雌激活胚分裂率依次降低，說明孤雌胚胎的分裂能力隨卵泡直徑的增大而增強;正常卵泡、小腔卵泡的卵母細胞體外成熟后，孤雌激活胚囊胚率隨卵泡直徑的增大有一定的增高，但變化不顯著;從豬小腔卵泡中抽出的卵母細胞有一定的發育能力，在收集卵母細胞的時候，也應該適當挑取一部分直徑小于2 mm的小腔卵泡，增加卵母細胞的數量，為試驗提供更多的材料。

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