茶葉中23株真菌的分離鑒定

管飄萍 Enkhbayar Munkhbayar 黃紫貝 黎順庚 嵇靜慧 陳詩涵 王海燕 劉文博 卞建春

摘要：我國茶葉特別是發酵茶葉中含有許多有益真菌，其代謝產物具有抗菌、抗癌、降脂、降壓的功能。目前，關于茶葉中真菌功能的研究很多，但在畜牧業中尚無相關應用研究。取湖南安化金花茯磚茶、天福南糯山熟餅、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱、祁門紅茶和金茯茶共8種茶葉進行真菌分離、純化，共得到23株菌株，通過形態學和ITS基因序列的鑒定，共得到擬莖點霉菌1株，變色栓菌1株，枝狀枝孢菌1株，黑曲霉2株，曲霉菌1株，冠突曲霉2株，阿姆斯特丹曲霉6株，棕曲霉2株，格孢菌1株，擴展青霉菌1株，擬盤多毛孢菌1株，球孢枝孢菌2株，變色曲霉2株。結果為這些真菌的進一步研究和在生產實踐中的應用提供了物質基礎。并且將其中的優勢菌屬冠突散囊菌進行擴大培養，為后期的生產實踐做好準備。

關鍵詞：茶葉;真菌;分離;鑒定;冠突散囊菌;阿姆斯特丹曲霉

中圖分類號：TS272.7;S182

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0285-06

茶葉種類繁多，不同國家的茶葉分類方法各有不同。我國根據出口茶類別，將茶葉一共分為7類，分別是綠茶、紅茶、黃茶、黑茶、白茶、青茶。祁門紅茶屬于紅茶，茯磚茶、普洱茶和天福南糯山熟餅屬于黑茶，天福白茶屬于白茶。

我國多種茶中存在有益的真菌，尤其是渥堆發酵的茶葉，其代謝產物具有降血脂[1-3]、抗動脈粥樣硬化[4-6]、抗菌以及抗氧化[7]等多種功能，冠突散囊菌就是其中之一，它是茯磚茶中的主要優勢菌種，是茯磚茶后段發酵的益生菌，可在茶葉上形成菌苔，呈金黃色，俗稱“金花”。冠突散囊菌能夠在高溫下存活并能產生各種胞外酶，能有效地催化茶葉中多酚、氨基酸和多糖等成分發生降解和轉化[8]。溫瓊英證實了冠突散囊菌能分解茶中單寧物質和淀粉，減少茶葉的苦澀口感，使茶味香醇[9]。黃群等的研究表明，冠突散囊菌有助于人體消化吸收淀粉和蛋白質[10]。目前這些研究主要集中于茶葉學和醫學領域，而在畜牧學方面的應用研究很少。本試驗于2019年在揚州大學動物醫院進行，擬從茶葉中分離出有益的真菌，研究其代謝產物和過程，并將其應用于畜牧學領域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶葉來源 試驗所用的茶葉均通過網購或者在茶葉店購買獲得，有湖南安化金花茯磚茶（2007）、天福南糯山熟餅、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱茶、祁門紅茶和湖南安化金茯茶（2014）共8種茶葉。

1.1.2 主要器材 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），Mini Plus小型離心機（Eppendorf 公司），PCR儀[愛普拜斯應用生物系統貿易（上海）有限公司]，DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠），冰箱，恒溫培養箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司），電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），電熱恒溫金屬?。ㄉ虾１壤蕛x器有限公司）等。

1.1.3 主要試劑和培養基 80萬U/支注射用青霉素鈉、100萬U/支注射用硫酸鏈霉素（山東魯抗醫藥股份有限公司）;Fungi Identification PCR Kit試劑盒[寶生物工程（大連）公司];TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒、Super GelRedTM 10 000×（蘇州宇恒生物科技有限公司）;馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉（上海中科昆蟲生物技術開發有限公司）;D（+）-無水葡萄糖（國藥集團化學試劑有限公司）;馬鈴薯浸粉（青島日水生物技術有限公司）;Trypton、Yeast Extract（Thermo Fisher Scientific公司），Agar（南京百斯凱科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 真菌培養

1.2.1.1 培養基的配制 PDA培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉39 g，加超純水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌15 min;改良LB培養基：Tpyptone 4 g，Yeast Extract 4 g，葡萄糖16 g，瓊脂粉6 g， 121 ℃ 高壓滅菌15 min。

1.2.1.2 茶葉樣本的處理 取購得的湖南安化金花茯磚茶（2007）、天福南糯山熟餅、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱、祁門紅茶和湖南安化金茯茶（2014），各5 g于15 mL離心管中，標記為 1～8，備用。用超純水溶解青霉素鈉和硫酸鏈霉素至終濃度分別為50 μg/mL和100 μg/mL，取 5.5 mL 加入上述8個離心管中，常溫孵育3 h。

1.2.1.3 真菌的培養 取200 μL上清液分別接種涂布于PDA固體平板和改良LB平板上，28 ℃，保濕培養。

1.2.2 真菌純化 蘸取分離培養得到的每種真菌的單個菌落，接種于PDA固體培養基中央，分別純化培養，共分離純化培養3次，直至形成單個菌落。

1.2.3 真菌鑒定

1.2.3.1 真菌DNA提取 取純化培養3次后的真菌，每個樣都取火柴頭大小，放入滅菌的1.5 mL離心管中，加入1 mL高壓滅菌后的磷酸緩沖鹽（PBS）溶液，充分振蕩混勻，加入直徑為0.5 mm的磁珠，用振蕩儀振蕩研磨 3 min 后，觀察樣本是否被充分研磨。如果仍然有大塊的樣本未被研磨破碎，則采取水煮裂解法，裂解10 min后，再次用振蕩儀研磨，直至樣本被研磨至無肉眼可見的大的團塊。以 12 000 r/min 的轉速離心 2 min，取上清液置于滅菌后的1 mL離心管中標號，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3.2 PCR反應擴增 試驗所需的真菌基因組DNA可通過試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit 提取，提取產物采用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

用于ITS序列擴增的反應體系見表1。擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，53 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環;最后72 ℃延伸 5 min。將獲得的陽性樣本的PCR擴增產物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序，使用Seq Forward Primer和Seq Reverse Primer進行DNA測序。測序引物序列為Seq Reverse Primer：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′;Seq Forward Primer：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′。

1.2.4 冠突散囊菌的擴大培養

1.2.4.1 液體培養基配制 PDA液體培養基：取49 g馬鈴薯浸粉，溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，備用;馬鈴薯安化茶湯培養基：將洗干凈的馬鈴薯去皮切塊，稱取200 g，加水煮沸 30 min，用紗布過濾，取濾液，加葡萄糖20 g，用去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

1.2.4.2 擴大培養 將純化好的冠突散囊菌分別接種于裝有300 mL PDA液體培養基和馬鈴薯安化茶湯培養基的錐形瓶中，于28 ℃下保濕培養。

2 結果與分析

2.1 真菌形態學鑒定

分離菌株純化后的菌落形態見圖1和表2。

2.2 真菌分子鑒定結果

23株分離株DNA經PCR擴增后的電泳結果見圖2、圖3。

測出序列后，將所得基因序列用EditSeq生物軟件正確打開后，進入NCBI網站主頁，選擇BLAST中的Nucleotide BLAST進行序列比對分析，再結合表型特征確定分離到的真菌的種類。其中，由于第6種茶葉天福普洱茶中未分離出真菌，因此沒有測序結果。將獲得的基因序列提交至GenBank上，得序列號MH395152～MH395172和MH424452～MH424453（表3）。

2.3 冠突散囊菌擴大培養結果

靜置培養5 d后，2種培養基中均出現菌落（圖4、圖5），但是馬鈴薯安化茶湯液體培養基中的菌落比PDA液體培養基中的菌落長得更快更多，能形成菌苔。

3 討論與結論

本試驗中茶葉真菌首先采用改良LB培養基和PDA培養基一起培養，純化時均采用PDA培養基培養。經試驗，所有菌株都生長良好。同一種茶葉中分離培養所得菌株，經分子學鑒定后為同一種真菌的形態也有所不同，如2-3和2-4以及3-2、3-3和3-4，它們為同一種真菌，但在PDA培養基上菌落形態不一致，因此用形態學方法很難進行具體區分，具體的鑒定還需要用分子生物學的方法。

在分離到的23種真菌中，主要的優勢菌屬為黑曲霉、冠突曲霉菌、阿姆斯特丹曲霉、棕曲霉和變色曲霉。在天福南糯山熟餅和天福茗茶中都分離到了黑曲霉;在天福茗茶和湖南安化金茯茶（2014）中都分離到了阿姆斯特丹曲霉;在天福白茶和祁門紅茶中都分離到了棕曲霉，由于以上3種真菌都是曲霉菌屬，可以得出，本試驗的大優勢菌屬就是曲霉菌屬。接下來將對優勢菌的代謝產物和代謝過程進行研究，評價其抑菌和抗癌作用，為其在畜牧業生產中的應用打下基礎。枝孢屬真菌是植物病原菌，分布廣泛，可以從土壤、空氣及各種有機質中分離得到。本試驗在湖南安化金花茯磚茶（2007）、祁門紅茶中均有分離到枝孢屬真菌，普洱茶發酵和貯藏中也發現有枝孢屬真菌[11]，目前對枝孢屬真菌的研究較少，有待進一步研究。擬莖點霉屬真菌既是重要的植物病原，可引起多種病害，又是植物的一種內生真菌，可與植物相互作用，目前已作為致病菌在多種植物中分離到[12-13]，本試驗在湖南安化金花茯磚茶（2007）和安吉普洱中也有發現，表明茶葉在生產過程中并未能完全抑制植物病原菌的生長，且有這類真菌的茶葉中冠突散囊菌等優勢真菌明顯較少，這些病原菌是否對茶葉的制作過程以及是否具有潛在毒性還需進一步研究。

冠突散囊菌作為茶葉中的優勢菌屬，且有降脂、抗菌、抗氧化等多種功能，對其進行擴大培養，結果發現，馬鈴薯安化茶湯液體培養基更適合冠突散囊菌的生長，生長速度明顯高于成品的PDA液體培養基，這可能是由于茶湯中含有更適于冠突散囊菌生長的營養物質，對此進一步研究可以優化冠突散囊菌的培養條件。

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