持續血漿趨化因子C-X-C基序配體12增加導致疼痛的慢性化

張輝 麥春林 許雅南 林震嘉 揭英桃 熊媖 唐源 劉先國 談智 周利君

1廣東省第二人民醫院麻醉科（廣州510317）；2中山大學中山醫學院生理教研室及中山大學疼痛研究中心（廣州510080）

急性痛對機體具有保護和預警作用，但控制不當就會轉化為慢性痛而成為一種疾病[1]。慢性痛在我國社會醫療負擔中位居第三[2]，其中外周神經損傷疾病或胸外科等術后引起的神經病理性疼痛較為常見，其主要表現為痛覺異常，即非傷害性刺激（如觸、壓、冷、熱）引起疼痛；痛覺過敏和自發性疼痛[3-4]。慢性痛非常頑固，嚴重干擾生活[5-6]，且目前缺乏有效的治療手段[7]，因此，預防慢性疼痛的發生尤其重要。盡管對疼痛的機制研究有30年以上歷史，但介導急性痛向慢性痛轉變的分子機制仍缺乏共識[8]。血液免疫是對外周神經損傷及病變的一道重要免疫防線，但慢性痛發生發展過程中循環血液免疫是否會發生變化，以及是否介導疼痛的慢性化過程還很不清楚。

趨化因子C-X-C基序配體12（CXCL12，又稱基質細胞衍生因子1/SDF-1）是一個新的神經系統調節因子。CXL12及其受體均在周圍和中樞神經系統痛相關結構中有表達，并通過中樞和外周機制及神經元和神經膠質機制參與病理性疼痛的發展和維持過程[9]。因而，CXCL12 通路可作為治療慢性疼痛的潛在靶點。本研究首先在小鼠保留性神經損傷（spared nerve injury，SNI）的經典慢性疼痛模型上觀察血漿CXCL12的時程性變化，再從正反兩個實驗初步探討這一變化與疼痛慢性化的關聯。

1 材料與方法

1.1 材料健康成年C57BL/6小鼠，7～10周，體質量（25±5）g 97只，雌性對半，由中山大學大學動物實驗中心提供。這些動物被安置在12 h的光/暗循環（07：00 燈光開關），可隨意獲得食物和水。室溫保持在（23±1）℃，濕度保持在50%～60%。所有的動物實驗程序都得到了中山大學動物倫理和使用委員會（IACUC）的批準。

1.2 方法

1.2.1 SNI依照以前的文獻進行SNI手術操作[10-11]。先將小鼠在2%異氟醚麻醉呼吸器下麻醉后，在左側大腿腘窩處中間作一縱行切口；辨認清楚坐骨神經及其三根分支（腓腸神經、腓總神經和脛神經），分離腓總神經和脛神經并用5-0 縫線結扎；再在結扎遠端剪斷0.2 mm的殘端，最后分層縫合肌肉和皮膚。手術過程忌觸碰或牽拉腓腸神經。假手術組僅暴露腘窩處坐骨神經三分支，不損傷神經。待動物麻醉蘇醒后正常飼養。

1.2.2 機械痛閾測試采用Von-Frey 纖維絲對小鼠的左后肢足底小魚際肌處進行垂直刺激，待其彎曲形成大S 形停止，刺激時間為4～6 s，若小鼠呈現縮足或舔足則為陽性反應，若無則為陰性反應。初始刺激力度設定0.4 g，單力度測5次，刺激間隔30 s，最大力度設定2.0 g。計算小鼠50%縮足反應閾值即為機械撤足閾值（paw withdrawal threshold，PWT）。在實驗前后不同時間點進行PWT 測定。其中SNI術前或靜脈注射CXCL12及其中和抗體前1～3 d的機械性縮足閾值均數記為小鼠初始PWT，靜脈注射后3～6 h后進行雙側痛行為學測試。

1.2.3 血漿樣本收集選取假手術組撤足閾值無明顯變化，而SNI后雙側爪子撤足閾值明顯降低的不同組小鼠收集血漿進行細胞因子的檢測（圖1）。各組小鼠在2%異氟醚麻醉呼吸器下麻醉后仰臥固定，然后自胸部剪開劍突至鎖骨下的皮膚和胸壁，撕開心包，暴露心臟；再用1 mL 注射器針頭扎入右心房，抽吸0.5～0.6 mL回心血液放入4℃EDTA抗凝管中，然后以3 000 r/min 速度離心15 min 吸取上層血漿標本于-80℃保存，用于后續細胞因子Western blot及Elisa檢測。

1.2.4 Western blot先取等量蛋白的血漿樣本，再加入loading buffer 混勻后加熱煮沸變性，接著取20 μL處理樣本上樣于12%SDS-PAGE 凝膠的樣本孔底進行電泳分離，再濕轉入0.45 μm PVDF 膜上。經5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后再在4℃環境下與兔單克隆抗體anti-CXCL12（1∶1 000、ab18919 Abcam）一抗輕搖孵育過夜。再與辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔二抗抗體（1∶5 000，Abcam）孵育1 h后，用ECL（Millipore公司）化學發光液顯色，Tanon-5200 化學發光成像系統（Tanon 科技公司）曝光，再經CCD 攝像頭拍攝顯影條帶，ImageJ 對圖像進行光密度分析。以假手術組的平均光密度為1 進行標準化，其他組的數據則為假手術組的倍數。

1.2.5 血漿CXCL12 ELISA測定血漿CXCL12的表達水平采用小鼠CXCL12 ELISA試劑盒（ab100741，Abcam）測定。簡而言之，取50 μL 血漿樣本應用于CXCL12 ELISA檢測，所有步驟依照產品說明書規范操作。最后經450 nm 波長的酶標儀測定吸光度值，繪制標準曲線計算樣品濃度。

1.2.6 尾靜脈注射重組小鼠CXCL12先將重組小鼠CXCL12蛋白質（P4371，Abnova）配置成100 μg/mL存儲液放在-80℃冰箱備用，給藥前再用0.1%BSA的生理鹽水中稀釋至工作濃度。為生物學仿生模擬小鼠SNI 9 d后血漿CXCL12 病理性濃度200 pg/mL（圖2D），成年小鼠（±25 g）的血漿容量約為1 mL，因此每只小鼠注射200 μL的1.0 ng/mL CXCL12 工作液，以在血漿中達到約200 pg/mL。此外，由于CXCL12的血半衰期＜30 min[20]，并且有其他多種血液細胞的影響，而且CXCL12 通過單核/巨噬細胞中的自分泌/旁分泌機制促進自身生產[21]，同時還增加兩個較高劑量的CXCL12 注射組（2.5、5.0 ng/mL的CXCL12 工作液，分別對應于500 pg/mL和1 000 pg/mL的血漿CXCL12 濃度）。給正常小鼠連續9 d 尾靜脈注射1.0 ng/mL CXCL12（200 μL，每天1次）。對照組為注射等量含0.1%BSA的無菌生理鹽水（vehi，圖3）。

1.2.7 尾靜脈注射CXCL12蛋白或CXCL12中和抗體根據ELISA 實驗，SNI模型小鼠血漿CXCL12的病理濃度高達200 pg/mL（圖1D），再依照CXCL12中和抗體（ab9797，Abcam）產品說明書提示，抗體濃度為CXCL12的20～40倍時對CXCL12 生 物 活性產生半數最大抑制【ND50】。因此，采用抑制病理性CXCL12的合適CXCL12 中和抗體量為20 ng。在中和實驗中，在注射外源性CXCL12或手術操作30 min 前并連續9 d（每天1次）通過尾靜脈注射200 μL 20 ng anti-CXCL12 抗體。對照組小鼠注射等量的無菌生理鹽水（vehi，圖4）。

1.3 實驗分組及設計（1）SNI術后血漿CXCL12濃度的時程變化：30只C57BL/6小鼠分為6組，雌性對半。其中空白對照（Contr）及SNI后1、3、9 d（SNI 1 d、SNI 3 d、SNI 9 d）各組5只，假手術3 d組（Sh3d/Sh）6只，SNI21d 4只。不同時間手術，同一時間取血分離血漿進行后續WB和Elisa 實驗。取材前進行痛行為學測試。（2）靜脈注射外源性CXCL12 對正常小鼠機械痛閾的影響：35只C57BL/6小鼠分為4組。溶劑對照（Vehi，n=9）及不同濃度CXCL12 3組（1.0 ng/mL 8只，2.5 ng/mL 10只，和5.0 ng/mL 8只）早上八點靜脈注射一次200 μL，連續9 d。在注射前后不同時間點進行機械痛閾測試。（3）靜脈注射CXCL12 中和抗體對CXCL12 與SNI誘導機械痛敏的影響：32只C57BL/6小鼠分為6組。除SNI組4只動物外，其他5組各5只：溶劑對照組（Vehi）、靜脈注射200 μL 2.5 ng/mL CXCL12組（2.5 ng/mL CXCL12）、靜脈注射200 μL 20 ng CXCL12 中和抗體組（anti-CXCL12）、靜脈注射CXCL12 中和抗體30 min后再靜脈注射CXCL12組（anti-CXCL12+CXCL12）、靜脈注射CXCL12 中和抗體30 min后再進行SNI組（anti-CXCL12+SNI）。早上八點靜脈注射，持續9 d。在注射前后不同時間點進行機械痛閾測試。

1.4 統計學方法采用SPSS 24.0 統計軟件進行分析，計量資料以均值±標準差表示。圖1各組行為學的結果和圖2WB、Elisa 結果，采用的是單因素方差分析來比較不同組間的差異，并用t檢驗進行組間比較。圖3和4的機械痛閾的結果，采用的是雙因素方差分析來比較不同組間的差異，并用Turkey′s 法進行多重比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNI后血漿CXCL12持續增加大量的研究表明外周損傷孫受周圍和中樞神經系統中的CXCL12明顯增加且廣泛參與病理性疼痛的發生發展過程[12-13]。但外周神經損傷后是否會影響血液CXCL12表達的變化還不是很清楚。因此，本研究首先觀察觀察外周神經損傷SNI模型后血液免疫中CXCL12是否發生變化。與筆者前期研究一致[14]，SNI后同側后肢的機械痛閾明顯下降，對側也出現相同的變化趨勢，但與手術側無明顯差異（圖1）。在痛行為學測試基礎上提取SNI后不同時間點的血漿進行Western blot檢測，結果顯示SNI1d 血漿CXCL12 明顯升高，3 d 達到高峰，9 d 維持不變（圖2A、2B）。ELISA結果進一步顯示，SNI后1～21 d 血漿CXCL12 水平逐漸升高，從假手術組（46.45±3.47）pg/mL 上升到（161.20±18.88）pg/mL（圖2C）。因此，SNI后血漿CXCL12 持續增多至少長達21 d，提示CXCL12 可能在疼痛的慢性化中起重要作用。

2.2 靜脈注射外源性CXCL12劑量依賴性引起機械痛覺過敏為了明確SNI后小鼠血漿CXCL12持續升高與疼痛的慢性化關聯，設計正反兩方面的實驗來進行研究。首先是在正常動物中補充病理濃度的CXCL12，觀察小鼠痛行為學的變化。由于CXCL12 半衰期很短（＜30 min）[15-16]，而Elisa結果顯示小鼠慢性痛條件下血漿CXCL12的病理性濃度大約為200 pg/mL，且持續增加21 d。首先采用尾靜脈注射不同劑量的外源性CXCL12（1.0、2.5、5.0 ng/mL，200 μL，每天1次，持續9 d）來模擬血漿CXCL12 病理濃度（200 pg/mL）的持續增加（圖3A）。痛行為學測試結果顯示（圖3B），與溶劑對照組相比（Vehi），靜脈注射1.0 ng/mL CXCL12在給藥5 d后才能顯著降低雙側機械痛閾；而2.5、5.0 ng/mL CXCL12 從第1次給藥后3 h 就能降低正常小鼠的機械痛閾，并隨給藥次數增加其作用越明顯。這表明血漿CXCL12 持續增加不僅是SNI 引起的血液免疫變化的結果，同時也是引起疼痛慢性化的重要原因。

2.3 中和CXCL12能緩解靜脈注射CXCL12與SNI引起的機械痛敏為明確血漿CXCL12增多是否為疼痛慢性化的必要條件，觀察中和血液CXCL12對靜脈注射CXCL12引起的機械痛敏影響，還有其對SNI誘導慢性痛的影響。在正常小鼠靜脈注射9 d CXCL12（2.5 ng/mL）或SNI模型上預防性給予20 ng 200 μL CXCL12 中和抗體（注射CXCL12 前30 min或SNI 前30 min及術后每天1次，持續9 d），然后通過機械測試觀察小鼠痛行為學變化情況（圖4A）。痛行為學結果顯示（圖4B），CXCL12中和抗體不影響假手術組小鼠的機械痛閾。CXCL12 中和抗體不僅能抑制靜脈注射2.5 ng/mL CXCL12 引起的雙側急性痛閾下降（6，2 h），也能抑制持續CXCL12 注射引起的慢性機械痛敏。此外，CXCL12中和抗體還能明顯緩解SNI 引起的機械痛敏。上述研究結果表明，表明血液中持續增加的CXCL12確實是導致神經病理性疼痛慢性化的重要原因。

3 討論

慢性疼痛是一種疾病，其中神經病理性疼痛是最嚴重的一類。各種神經損傷如胸科等外科術后[17]神經痛、帶狀皰疹后遺神經痛、多發性硬化、糖尿病外周神經痛等疾病不僅引起劇烈、持續且毀滅性的疼痛，且與疾病最初反應不成比例，嚴重影響患者的生存質量。因此，慢性痛的高發病率以及社會危害不言而喻。此外，神經病理性疼痛的治療仍是臨床尚未解開的難題之一。

一般認為，慢性痛的發病機制主要包括外周敏化和中樞敏化[18]。研究顯示外周神經損傷通過神經通路引起脊髓中樞敏化及膠質細胞激活，激活的膠質細胞通過合成和釋放多種致炎趨化因子也能影響中樞敏化介導疼痛的慢性化[11，18-20]。但單側外周神經損傷不僅引起同側慢性痛，而且也會引起對側肢體相應部位出現與患側肢體相同的持續性疼痛，即鏡像痛（mirrorpain）。SNI只在損傷側產生機械異位痛，而對側則沒有。但GRACE 等[21-23]和筆者[14]的研究表明，SNI 以及其他單側外周神經損傷也可以在同性別同種屬動物中引起雙側痛覺過敏。此外，持續的慢性痛還會引起雙側海馬、前額葉皮質等高位中樞神經回路的功能和結構重塑及神經炎癥從而導致感知和行為的長期變化（記憶障礙和抑郁）等共病現象[24-25]。這一現象不僅在實驗動物中得到證實[11-26]，而且也有臨床證據支持[27]。這些變化都不能僅僅從痛覺的神經傳導通路來解釋，而可能與全身的血液免疫有關。本研究也發現SNI 確實可引起非結扎側的機械痛閾下降，即痛覺異常（圖1）。同時也觀察到SNI后血漿CXCL12 持續增加，這與筆者前期研究發現SNI后血漿TNF-α、IL-1β增加一致[24，26]，表明外周神經損傷后血液免疫確實發生了變化。進一步的研究顯示在正常動物靜脈被動注射外源CXCL12 模擬血液CXCL12 持續增加確實能引起雙側機械痛閾下降（圖3B）。而且，靜脈注射CXCL12的中和抗體不僅能緩解SNI 引起的同側機械痛敏，也能緩解非結扎側的痛覺異常（圖4B 右）。這一結果進一步證實血液CXCL12增加是引起鏡像痛的必要條件。因此，這一結果有效地揭示了SNI 產生鏡像痛的機制，同時也進一步證實外周神經損傷引起的血液免疫的變化可能是引發雙側疼痛的重要誘因。

近年來多種慢性痛模型上的研究發現，CX-CL12表達不僅在痛覺通路的一級神經元脊神經節（DRG）中表達增加，而且脊髓及其以上的中樞神經系統的神經元和小膠質細胞及星型膠質細胞中也明顯增加；鞘內注射CXCL12（250 ng）能引起持續3 d的機械痛敏和2 d的熱痛敏，CXCL12 中和抗體或阻斷CXCR4 受體通路都能減輕神經病理性疼痛[28-29]。這些結果都表明CXCL12在病理性疼痛的發展和維持中起著關鍵作用，并且神經元和神經膠質機制也參與CXCL12/CXCR4 軸向介導的疼痛處理過程。本研究從外周循環免疫的全新角度來探查血漿CXCL12在神經病理性疼痛動物模型上的變化及其意義。本研究發現血漿CXCL12水平從SNI后1 d 持續增加，持續至少21 d（圖2），這提示血漿中變化的CXCL12 可能與疼痛的慢性化密切相關。為了證實血漿CXCL12上升不僅僅是一種神經炎癥的伴隨變化，還在急性疼向慢性疼轉化中起著關鍵作用，本研究設計了正、反兩組實驗。首先采用連續尾靜脈注射的辦法來觀察被動增加血漿CXCL12 對正常小鼠痛行為學的影響，發現靜脈注射病理濃度的CXCL12 確實會劑量依賴性引起雙側痛覺過敏（圖3）。接著通過靜脈注射CXCL12 中和抗體來阻斷CXCL12 作用后對已產生病理性疼痛動物痛行為學的影響。中和CXCL12不僅能抑制靜脈注射CXCL12 引起的慢性痛，而且也能緩解SNI 引起的機械痛敏（圖4）。這表明血液中持續增加的CXCL12 確實與鏡像痛的產生有關，并且與疼痛的慢性化有關。因而，抑制血液CXCL12增加或者阻斷CXCL12 通路能有效阻止疼痛慢性化。

圖1 用于收集血漿樣本的各組小鼠痛行為學測試結果Fig.1 Pain behavior test results of each group of mice used to collect plasma samples

圖2 SNI后血漿CXCL12 持續增加Fig.2 Continuous increase of plasma CXCL12 after SNI

圖3 靜脈注射不同濃度的外源性CXCL12 對正常小鼠機械痛閾的影響Fig.3 Effects of intravenous injection of exogenous CXCL12 at different concentrations on mechanical pain threshold in normal mice

圖4 靜脈注射CXCL12 中和抗體對CXCL12 與SNI 引起機械痛敏的影響Fig.4 Effects of CXCL12 neutralizing antibody on mechanical pain sensitivity induced by CXCL12 and SNI in intravenous injection

綜上所述，本研究發現外周神經損傷后血漿CXCL12 持續增加，并從正反兩個角度證實血漿CXCL12 持續增加是急性痛轉化為慢性神經病理性疼痛的關鍵。本研究首次從血液免疫角度揭示血漿CXCL12 持續增加為疼痛慢性化的充分必要條件，為急性痛轉化為慢性痛的機制提供理論基礎，為開發鎮痛新藥提供新靶點和依據。同時本研究也初步證實了循環免疫在慢性病理性疼痛中的重要作用。接下來可結合臨床慢性神經病理性疼痛等多種慢性痛患者血液免疫的變化來進一步探討血漿CXCL12增多的臨床共性以及臨床意義；同時血漿CXCL12增多及其導致疼痛的慢性化的具體機制也有待進一步闡明。