叉頭框蛋白O亞型3a和p27激酶蛋白抑制劑1在電針促進面神經(jīng)再生中的作用研究※

鄭紅弟 費 靜 余莉亞 李雷激

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 瀘州 646000)

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，面癱在我國的發(fā)病率為每年26～34/10萬人，患病率為每年258/10萬人，據(jù)此，我國每年將至少有335萬人患此病[1]，因而，研究面神經(jīng)損傷的修復(fù)具有重要的臨床意義。已有大量臨床報道證實，針灸治療周圍性面癱療效確切。隨著電針的普遍應(yīng)用，患者的治愈率得到了較大提高[2]，但電針治療周圍性面癱的機制尚不明確。

面神經(jīng)損傷后修復(fù)是多因素綜合作用的結(jié)果，目前針對神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子的研究很多，關(guān)于細胞周期調(diào)節(jié)因子在面神經(jīng)損傷后修復(fù)中作用研究尚少見，在坐骨神經(jīng)損傷后修復(fù)中的作用研究多見。叉頭框蛋白O亞型3a(Foxo3a)和p27激酶蛋白抑制劑1(p27 kip1)是重要的細胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Foxo3a是叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Foxo)的一種，F(xiàn)oxo3a轉(zhuǎn)錄后磷酸化受磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)調(diào)節(jié)，當(dāng)Akt途徑被抑制時，F(xiàn)oxo3a被激活，從細胞質(zhì)導(dǎo)入細胞核，從而阻止細胞增殖，導(dǎo)致細胞死亡[3-4]。p27 kip1是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族的一員，通過抑制激酶活性而抑制細胞周期，對損傷后修復(fù)有重要影響[5-6]。Foxo3a可調(diào)節(jié)下游基因p27 kip1，p27 kip1可抑制細胞周期蛋白D1,使細胞周期停滯在G0/G1期，從而阻止細胞增殖[3，6]。查閱文獻，既往無探究面神經(jīng)壓榨性損傷后，F(xiàn)oxo3a和p27 kip1在電針促進面神經(jīng)修復(fù)中的作用的相關(guān)研究。本實驗旨在研究Foxo3a和p27 kip1在面神經(jīng)壓榨性損傷大鼠腦橋面神經(jīng)核團段腦組織中的表達情況以及電針對兩者表達是否存在影響，以進一步探索電針治療周圍性面癱可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD雄性大鼠42只，3～5月齡，體質(zhì)量250～300 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供，實驗動物合格證號：SYXK(川)2018-065。本實驗通過西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查，批準(zhǔn)號：201909-5。

1.1.2 主要試劑 Foxo3a一抗、p27 kip1一抗、β-actin一抗[Abcam，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、蛋白免疫印跡(Western Blot)一抗稀釋液、放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)超敏發(fā)光液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 主要儀器 G6805-1A型電針治療儀(青島鑫升實業(yè)有限公司)，無菌針灸針(北京天宇科技發(fā)展有限公司)，勻漿器(上海安亭科學(xué)儀器廠),-80 ℃冰箱、蛋白濃度分析儀(美國Thermo Fisher公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，低溫高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，全自動發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司)，石蠟包埋機(蘇州市蘇信凈化設(shè)備廠)，石蠟切片機(美國Sigma公司)，恒溫干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，倒置顯微鏡(中國奧林巴斯有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制作 將42只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為3組，即正常組6只、模型組18只、電針組18只。正常組不予任何處理，正常飼養(yǎng)；模型組、電針組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后均采用同樣的方法由同一人獨立完成制作右側(cè)面神經(jīng)上頰支壓榨性損傷模型全過程。10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，右側(cè)面部備皮后于口角與耳屏之間做一長約2 cm“弧形”切口，止血鉗鈍性分離皮下組織，暴露面神經(jīng)上頰支，長約1～2 cm，用蚊式止血鉗滿扣夾持面神經(jīng)上頰支，持續(xù)30 s，松開30 s，再夾持30 s[7]，面神經(jīng)壓榨完成后逐層縫合切口，消毒周圍皮膚，將大鼠放置于37 ℃加熱墊上復(fù)蘇，并分籠在同種環(huán)境下飼養(yǎng)，常規(guī)預(yù)防感染。

1.2.2 干預(yù)方法 正常組不做任何處理。模型組每日單獨固定于自制鼠板上30 min，不做任何治療。電針組予電針治療，第1次為術(shù)后2 h，將大鼠固定在自制鼠板上，取右側(cè)地倉(口角外1.0 cm)、右側(cè)頰車(下頜角前上方咬肌最隆起之處)2個穴位配對，選用直徑0.25 mm，長度1.5 cm無菌針灸針，針刺深度5 mm，刺入穴位后接電針治療儀治療。治療儀參數(shù):電流40～50 μA，電壓2 V，頻率18～20 Hz，疏密波，強度以頰肌輕微顫動為宜。15 min后交換配對電極，每次30 min，每日治療1次。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 標(biāo)本取材 正常組于適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用腹腔過度注射10%水合氯醛麻醉后，斷頭法處死大鼠，直接取材。模型組、電針組分別于術(shù)后第4、14、28 d取材(每組每個時間點分別隨機抽取3只大鼠)。①Western Blot檢測取材方法：采用腹腔過度麻醉后斷頭處死大鼠，用剪刀剪開大鼠頸背部皮膚后離斷頭顱，鷹嘴鉗咬除顱骨暴露腦組織，右側(cè)聽神經(jīng)根保留以作為術(shù)側(cè)的標(biāo)記，去除小腦的四疊體，保留腦橋四疊體區(qū)域(腦橋中、下段)，將組織于無菌盤中用磷酸緩沖溶液(PBS)沖洗去除血液后，從上向下分為3塊，每塊厚度不超過3 mm，置于清潔凍存管于-80 ℃冰箱保存。②切片標(biāo)本取材方法：將模型組、電針組每個時間點剩余的3只大鼠腹腔過度麻醉后固定于自制鼠板，腹部切口暴露腹白線，剪開腹膜找到腹主動脈并結(jié)扎，暴露心臟，剪開右心耳，將輸液針自左心室插入主動脈，持續(xù)緩慢灌注0.9%氯化鈉注射液至右心耳處流出的液體清亮為止，再繼續(xù)予4%多聚甲醛灌注進行預(yù)固定。按照Western Blot檢測取材方法進行取材，將取下的腦橋中、下段繼續(xù)置于4%多聚甲醛中固定,經(jīng)過修剪、脫水、透明后浸蠟包埋成石蠟塊。

1.3.2 腦橋中、下段腦組織HE染色觀察 將各組大鼠腦組織石蠟塊切片、展片、45 ℃恒溫箱中烤干，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水后依次放入蘇木素溶液染色，再用流水沖去余色，1∶400氨水沖15 s，再用自來水沖洗10 min，入蒸餾水片刻，伊紅染色3 min，低濃度到高濃度酒精依次脫水，入二甲苯透明后滴上中性樹脂，最后蓋玻片封片，將玻片置于倒置顯微鏡下觀察，先于低倍鏡(×100)下找到聚集成團的大多角形面神經(jīng)元細胞，再于高倍鏡(×200)下觀察神經(jīng)元細胞的形態(tài)，并拍照。

1.3.3 Western Blot檢測 根據(jù)蛋白提取液說明書步驟提取各組大鼠腦橋中、下段腦組織蛋白，并使用二喹啉甲酸(BCA)法進行濃度測量后100 ℃蛋白變性10 min，-20 ℃冰箱保存。制備SDS-PAGE凝膠，按照每孔40 μg蛋白量分別加入上樣孔進行電泳分離90 min。然后依次進行轉(zhuǎn)膜60 min、室溫下脫脂牛奶封閉2 h、TBST緩沖液漂洗干凈，再將膜置于一抗稀釋液Foxo3a(1∶1 000)、p27 kip1(1∶2 000)4 ℃冰箱過夜；第2 d將膜用TBST緩沖液漂洗干凈后再置于二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L) 、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L) ](1∶1 000)稀釋液中常溫?fù)u床上孵育60 min，TBST緩沖液漂洗干凈后使用ECL超敏發(fā)光液進行發(fā)光，全自動發(fā)光分析儀顯影后Image J圖像處理軟件處理條帶，測出目的條帶與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值比值以表示目的蛋白的相對表達量。

1.3.4 免疫組化檢測 各組大鼠腦橋中、下段腦組織石蠟塊切片二甲苯脫蠟至水，再依次進行高壓抗原熱修復(fù)、滅活內(nèi)源性酶、5%牛血清白蛋白(BSA)室溫下封閉20 min，然后于37 ℃恒溫箱中孵育一抗2 h，PBS溶液洗3次，每次5 min，室溫下孵育二抗20 min，PBS浸洗后行DAB室溫顯色10 min，蘇木素復(fù)染3 min，最后依次脫水、透明、封片，60 ℃烤箱烘干，顯微鏡下觀察陽性反應(yīng)細胞數(shù)并拍照。免疫組化陽性細胞的標(biāo)準(zhǔn)：胞體直徑約20 μm,神經(jīng)元細胞漿及軸突內(nèi)含有棕黃色顆粒。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 正常組大鼠精神、食欲正常，體質(zhì)量較術(shù)前增加，觸須運動正常，雙側(cè)對稱，鼻尖均居中，雙側(cè)眼瞼閉合正常。模型組、電針組大鼠造模后全部存活，未出現(xiàn)傷口感染、傷口不愈合等情況，麻醉蘇醒后術(shù)后第1 d觀察所有造模大鼠表現(xiàn)為右側(cè)眼瞼下垂、不能閉合，右側(cè)胡須節(jié)律性擺動消失，鼻尖偏向健側(cè)。

2.2 各組大鼠腦橋中、下段腦組織面神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察 正常組低倍鏡(×100)視野下可見聚集成團的大多角形運動細胞面神經(jīng)元細胞；高倍鏡(×200)下可見面神經(jīng)元細胞輪廓清晰、結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)染色均勻，大而圓的藍色胞核位于細胞中央。模型組低倍鏡視野下見面神經(jīng)元細胞稍分散，邊界模糊，細胞突起減少，隨著時間推移，第14、28 d細胞數(shù)目、細胞突起逐漸增多；高倍鏡下見胞質(zhì)染色不均勻，核仁不居中。電針組第4、14、28 d在低倍鏡和高倍鏡下的面神經(jīng)元細胞數(shù)目及形態(tài)學(xué)與模型組呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，但同一時間點電針組細胞團較模型組細胞團聚集,邊界更清晰，細胞數(shù)目更多，面神經(jīng)元細胞突起增多(見插1，圖1)。

2.3 各組大鼠腦橋中、下段腦組織Foxo3a、p27 kip1蛋白表達比較 見表1。

表1 各組大鼠腦橋中、下段腦組織Foxo3a、p27 kip1蛋白表達比較

由表1可見，術(shù)后第4 d，模型組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達低于正常組(P<0.05)，電針組低于模型組(P<0.05)；術(shù)后第14 d，模型組、電針組Foxo3a及p27 kip1蛋白表達均較本組第4 d增高(P<0.05)，但仍低于正常組(P<0.05)，電針組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達低于模型組同期(P<0.05)；術(shù)后第28 d，模型組、電針組Foxo3a蛋白表達與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組p27 kip1蛋白表達與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，電針組p27 kip1蛋白表達與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，電針組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達與模型組同期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組、電針組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達均高于本組第14 d(P<0.05)。模型組、電針組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達隨著時間的推移均表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(見圖2)。

圖2 各組大鼠腦橋中、下段腦組織第4、14、28 d Foxo3a和p27 kip1蛋白條帶圖

2.4 各組大鼠腦橋中、下段腦組織面神經(jīng)元中Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數(shù)比較 見表2。

表2 各組腦橋中、下段腦組織面神經(jīng)元中Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數(shù)比較 個，

由表2可見，術(shù)后第4 、14 d模型組Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數(shù)均低于正常組(P<0.05)，術(shù)后第28 d，模型組Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數(shù)與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第4 、14 d電針組Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數(shù)均低于正常組及模型組同期(P<0.05)；術(shù)后第28 d，電針組與模型組Foxo3a陽性細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，電針組p27 kip1陽性細胞數(shù)低于模型組同期(P<0.05)。術(shù)后第4、14、28 d模型組、電針組Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數(shù)后一時間點均高于本組前一時間點(P<0.05)。

正常組大鼠Foxo3a在面神經(jīng)元中有較高表達，免疫反應(yīng)陽性信號主要在面神經(jīng)元細胞質(zhì)表達。術(shù)后第4 d，F(xiàn)oxo3a在模型組、電針組面神經(jīng)元中均有表達，主要表達在細胞質(zhì)，細胞核表達少。術(shù)后第4、14 d，模型組Foxo3a陽性細胞數(shù)均低于正常組，呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，術(shù)后第4 d陽性細胞數(shù)最少，隨之逐漸升高，直到術(shù)后第28 d，模型組陽性細胞數(shù)接近正常組。電針組與模型組相比，術(shù)后第4、14 d電針組Foxo3a陽性細胞數(shù)均低于模型組；術(shù)后第28 d，電針組接近模型組Foxo3a陽性細胞數(shù)(見插2，圖3)。

正常組大鼠面神經(jīng)元細胞中可見p27 kip1陽性表達，且高倍鏡下顯示細胞質(zhì)及細胞核均可見免疫組化陽性反應(yīng)信號，細胞質(zhì)表達強于細胞核。術(shù)后第4、14 d，p27 kip1在模型組及電針組面神經(jīng)元中均有表達，在細胞質(zhì)及細胞核中均有表達，但細胞核中的陽性表達明顯強于細胞質(zhì)。與正常組相比，術(shù)后第4 、14 d模型組p27 kip1陽性細胞數(shù)呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，術(shù)后第4 d陽性細胞數(shù)最少，至術(shù)后第28 d接近正常組。電針組與模型組相比，相同時間點的電針組均比模型組陽性細胞數(shù)低，也呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，到第28 d，電針組陽性細胞數(shù)仍比模型組少(見封3，圖4)。

3 討 論

世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦面癱是針灸最適宜治療的病種之一。目前，電針治療面神經(jīng)損傷被臨床廣泛應(yīng)用，并取得了顯著療效。研究表明，急性期電針治療可明顯提高痊愈率、顯效率,療效比單純針刺治療好,能明顯加快面神經(jīng)傳導(dǎo)和面神經(jīng)功能恢復(fù),痊愈所需天數(shù)明顯縮短[8-10]。但電針治療面神經(jīng)損傷的具體機制仍處于研究階段。地倉穴位于口角外側(cè)，主治口眼斜、流涎、唇齒不收等，穴區(qū)深層有面神經(jīng)頰支及面動脈分布，是治療周圍性面癱最常用的穴位之一；頰車穴位于下頜角前上方咬肌最豐隆處中心點，與地倉穴同屬足陽明胃經(jīng)穴，主治口眼斜、頰腫、面肌痙攣、流涎等，也為治療面癱的主穴[11]。因此，地倉、頰車常配伍治療口眼斜等病癥。故本實驗采用電針于面神經(jīng)壓榨性損傷急性期刺激地倉、頰車，觀察電針對大鼠面神經(jīng)損傷修復(fù)的影響。

神經(jīng)再生修復(fù)需要經(jīng)過一系列復(fù)雜的過程，可能涉及再生的微環(huán)境，周圍細胞及其產(chǎn)生的不同物質(zhì)，遺傳因素及機體的應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)等。據(jù)既往研究顯示，神經(jīng)纖維再生修復(fù)的過程涉及細胞的再生及再生過程中一些細胞周期蛋白的調(diào)節(jié)，F(xiàn)oxo3a、p27 kip1就是其中2種重要的負(fù)性細胞周期調(diào)節(jié)因子[12]。Foxo3a通過PI3K-Akt通路與胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白14-3-3特異性結(jié)合后從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，發(fā)生泛素化降解從而失去轉(zhuǎn)錄活性，促進細胞增殖。當(dāng)PI3K-Akt途徑被抑制時，去磷酸化的Foxo3a大部分進入細胞核，導(dǎo)致細胞凋亡[4，13]。本實驗結(jié)果表明，面神經(jīng)頰支壓榨性損傷后，術(shù)后第4 d腦橋組織面神經(jīng)元中Foxo3a表達量下降，隨時間進展逐漸恢復(fù)正常。王友華等[6]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)oxo3a在大鼠坐骨神經(jīng)損傷后背根神經(jīng)節(jié)中的表達先下降，再逐漸恢復(fù)接近正常，與本實驗結(jié)果趨勢一致。Foxo3a表達量下降可能是由于PI3K-Akt通路激活，磷酸化的Foxo3a發(fā)生泛素化降解失去轉(zhuǎn)錄活性，從而促進細胞增殖，這與免疫組化結(jié)果面神經(jīng)損傷后Foxo3a陽性信號主要集中在細胞質(zhì)以及模型組、電針組陽性細胞數(shù)少于正常組相吻合。PI3K-Akt-Foxo3a通路除了調(diào)節(jié)細胞周期外，在氧化應(yīng)激方面也發(fā)揮重要作用[14]。面神經(jīng)受到外界損傷后發(fā)生周圍組織腫脹、炎癥刺激、面神經(jīng)缺血缺氧，為抵抗損傷，F(xiàn)oxo3a表達量應(yīng)增高，但本實驗結(jié)果顯示術(shù)后第4 d模型組及電針組均較正常組低，可能系此階段Foxo3a下降發(fā)揮細胞周期調(diào)節(jié)效應(yīng)大于炎癥刺激使Foxo3a蛋白表達增高的效應(yīng)，故綜合兩效應(yīng)最終表現(xiàn)為Foxo3a在腦橋中、下段腦組織面神經(jīng)元中表達量下降，但電針組較模型組Foxo3a下降更顯著，可能是因為電針治療使面神經(jīng)周圍腫脹減輕，炎癥刺激降低，導(dǎo)致Foxo3a升高抵抗炎癥及應(yīng)激的效應(yīng)比模型組低。因此，推斷面神經(jīng)損傷后，電針可以促進面神經(jīng)元中Foxo3a表達量下降來加速細胞周期，促進神經(jīng)損傷修復(fù)。

p27 kip1參與細胞周期的負(fù)性調(diào)控。p27 kip1是Foxo3a的下游基因，F(xiàn)oxo3a的活化還能增強具有抑制細胞周期G1期向S期過渡的細胞周期抑制蛋白的表達[15-16]，F(xiàn)oxo3a也可以在核內(nèi)上調(diào)p27 kip1誘導(dǎo)細胞生長周期停滯。且有報道大量細胞株可以通過Foxo轉(zhuǎn)錄抑制來降低p27 kip1的表達，從而促進細胞增殖[12]，故推測面神經(jīng)損傷后p27 kip1下降受Foxo3a轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。本實驗結(jié)果顯示,術(shù)后第4 d，電針組p27 kip1表達量較模型組、正常組低(P<0.05)。結(jié)合Foxo3a在面神經(jīng)元中的表達趨勢，印證了面神經(jīng)損傷后p27 kip1下降受Foxo3a轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控的推測。神經(jīng)損傷后會發(fā)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，面神經(jīng)元中蛋白會發(fā)生很多改變，這些蛋白改變可以幫助神經(jīng)元細胞對抗外界損傷，減少對自身的損傷，幫助其修復(fù)和再生。王巍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在面神經(jīng)損傷后6 h面神經(jīng)核神經(jīng)元p27 kip1蛋白表達量即開始升高，損傷后12 h達高峰后逐漸下降，損傷后1周左右面神經(jīng)核神經(jīng)元p27 kip1蛋白表達量再次增高，表明面神經(jīng)核神經(jīng)元p27 kip1蛋白升高在面神經(jīng)損傷早期起到抵抗炎癥損傷的作用，后期與面神經(jīng)修復(fù)有關(guān)。本實驗測得第4 d模型組p27 kip1低于正常組(P<0.05)，結(jié)果與文獻[17]的研究基本一致，電針組比模型組表達量更低(P<0.05)，推斷可能是由于電針緩解了面神經(jīng)損傷早期的炎癥反應(yīng)及應(yīng)激刺激，故與模型組比較，電針組面神經(jīng)損傷早期p27 kip1升高不明顯，加之Foxo3a的調(diào)節(jié)使電針組p27 kip1表達量比模型組更低，更有利于神經(jīng)修復(fù)。

綜上所述,電針能加快面神經(jīng)損傷的修復(fù)，其機制可能與綜合調(diào)控p27 kip1、Foxo3a表達量從而影響細胞周期有關(guān)。