大腸桿菌與腸道沙門菌混合感染朗德鵝的診斷分析

蘭仕梅，王方國,2，張曉亮，袁婷,3，陳勝利，儲岳峰*

(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046；2.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 610000；3.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832001)

朗德鵝，又名西南灰鵝，原產于法國西部，世界著名肥肝生產的優秀品種[1]。因該品種鵝的肥肝營養豐富，質地細膩，味道獨特，被譽為“世界綠色食品之王”。盡管集約化養殖得到全面推廣，但傳染病仍是制約其發展的重大因素。大腸桿菌和腸道沙門菌是典型的人畜共患病原菌，是引起食源性疾病暴發的常見病原體，嚴重威脅著世界各國公共衛生安全，同時也是造成幼畜禽大批死亡，影響其健康生長和產品質量的重要細菌性傳染病病原體[2-4]。因大腸桿菌和沙門菌血清型眾多，針對性的疫苗研制和防控非常困難，往往采取藥物防治方法，但目前嚴重的多重耐藥性問題給養殖場造成了巨大的防控困難。本試驗從暴發雛鵝急性死亡的朗德鵝養殖場中患有腹瀉、精神萎靡等癥狀的發病朗德鵝幼雛組織上分離鑒定出1株腸道沙門菌和2株大腸桿菌，并進一步對分離株進行了小鼠致病性試驗和藥物敏感性試驗，為獸醫臨床防控朗德鵝大腸桿菌和沙門菌引起的混合感染提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2019年6月，蘭州市某朗德鵝養殖場9日齡雛鵝大批出現腹瀉、急性死亡等癥狀，3日內約40%雛鵝死亡，未死亡雛鵝主要表現為腹瀉、呼吸急促、精神萎靡、不食、扎堆、被毛雜亂。該場將未死亡雛鵝(12日齡)送至實驗室進行剖檢觀察，并采集心臟、肝臟、腎臟等組織進行病原分離鑒定。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)，營養肉湯(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)，水解酪蛋白(MH)培養基(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)，麥康凱培養基(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)，伊紅美藍培養基(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)，藥敏紙片(杭州濱河微生物有限公司)，細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，EmeraldAmp?MAX PCR Master Mix(寶生物工程(大連)有限公司)，DNA Marker DL2000(寶生物工程(大連)有限公司)，瓊脂糖(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.3 實驗動物

清潔級昆明小鼠12只，體重為(20 ± 2)g，由蘭州獸醫研究所實驗動物中心提供。

1.4 剖檢觀察和細菌分離純化

對病雛鵝進行剖檢觀察并記錄，采集心臟、肝臟、腎臟等組織樣劃線接種于TSA培養基、麥康凱培養基、伊紅美藍培養基，37 ℃ 培養16～24 h，挑取單菌落進一步純化培養，然后對純化菌落進行革蘭染色，鏡檢觀察。

1.5 細菌16S rRNA擴增測序

取上述純化菌落接種于營養肉湯中培養，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取培養物基因組作為模板，以細菌16S rRNA基因通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增分離株 16S rRNA基因[5]，引物由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。

PCR反應體系：總反應體積為25 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共 35個循環；72 ℃最后延伸 10 min，4 ℃保存。反應結束后，將PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并按照DNA膠回收試劑盒說明書進行切膠回收，送西安擎科澤西生物科技有限責任公司進行測序。

1.6 16S rRNA基因同源性分析和系統發育樹的構建

將分離菌的16S rRNA基因測序結果提交至NCBI，進行BLAST比對，下載GenBank中相關序列，利用MEGA 7軟件進行系統發育樹的構建。

1.7 小鼠致病性試驗

將純化的分離菌接種到營養肉湯中培養16～24 h，采用紫外分光光度計測定菌液OD600值并調整至1，此時菌液濃度約為1～1.5×108CFU/mL，將12只小鼠隨機分成4組，每組3只，試驗組(Ⅰ～Ⅲ組)腹腔注射3株不同菌液各0.25 mL，對照組腹腔注射等量生理鹽水，觀察小鼠臨床癥狀、死亡情況和病理變化并記錄。

1.8 抗菌藥物敏感性試驗

參照文獻[6]的抗菌藥物敏感性試驗紙片法執行標準以及文獻[7-8]進行結果評判。從TSA瓊脂培養基中挑取純化培養物3～5個菌落接種到營養肉湯中培養2～6 h，采用紫外分光光度計測定菌液OD600值并調整至1，此時菌液濃度約為1～1.5×108CFU/mL，采用無菌棉簽均勻涂布至MH平板上，取藥敏紙片放置在平板上，37 ℃ 培養16～24 h后測定抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 病理觀察

剖檢雛鵝可見心包、肝表面、肋骨以及后肢大腿肌肉上均附著大量纖維素性滲出液，心包渾濁，有積液，呈現纖維素性心包炎，膽囊腫大，肝表面覆蓋著一層灰白色纖維素膜狀物。

2.2 細菌分離培養和形態學觀察

分離菌在伊紅美蘭培養基上呈現2種菌落，一種黑色帶金屬光澤，另外一種為透明無色菌落；在麥康凱培養基上生長分別為粉紅色不透明和無色半透明菌落；在TSA培養基上生長均為半透明灰白色菌落。革蘭染色結果顯示所有菌株為陰性桿菌，無芽胞。

2.3 16S rRNA測序結果和系統進化樹構建

將16S rRNA測序結果上傳NCBI，經BLAST分析后，結果1株為腸道沙門菌，命名為19129株；2株為大腸桿菌，分別命名為T19130株和T19131株。從基于16S rRNA 序列所構建的NJ系統發育樹可知，以3株大腸桿菌標準菌株的16S rRNA序列作為外類群可將進化樹分為3個組群，其中本次分離19129株與腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種聚為簇2，表明可能為腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種，與豬源腸道沙門菌JQ975904菌株表現出較高的同源性(圖1)。圖2以肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)作為外類群可將進化樹分為2個組群，其中本次分離株T19130和T19131與大腸桿菌聚為簇1，表明分離株為大腸桿菌。其中T19131與人源菌株CP008697同源性較高，而T19130則表現出與鴨源菌株JX267124具有較高的同源性。

?本試驗分離菌株

?本試驗分離菌株

2.4 致病性試驗

接種細菌12 h后，菌株19129、T19130和T19131攻毒小鼠皆表現為精神沉郁、蜷縮在一角，目光呆滯，不采食，16 h后開始出現死亡，1周內死亡數量分別為2、2和1只，死亡率分別為66.7%、66.7%和33.3%。剖檢小鼠，急性死亡小鼠未見明顯病理變化，其余發病和死亡小鼠心包、肝表面附著有大量纖維素性滲出液，取肝臟和心臟等組織可分離出病原菌。對照組小鼠表現正常。

2.5 藥敏試驗

由表1可知，從雛鵝病變組織上分離出的3株細菌對諾氟沙星、阿莫西林、氨芐西林、環丙沙星、強力霉素等耐藥；3株分離菌對呋喃唑酮、復方新諾明、多黏菌素B敏感；除此之外，T19130和T19131菌株對美羅培南、大觀霉素藥物敏感。

表1 分離菌藥物敏感性試驗結果

3 討論

家禽養殖發展一直以來就極易受到各種傳染病的制約，其中大腸桿菌和沙門菌是危害養禽業最主要的細菌性病原[9]，往往造成大批家禽死亡，或是造成弱雛影響生產效益，而目前難以解決的耐藥性問題使得禽大腸桿菌病和沙門菌病難以防控。

禽大腸桿菌病每年都會給全球養禽業造成重大的經濟損失[10]，其病原為禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicE.coli，APEC)，是人源腸外致病性大腸桿菌毒力基因的潛在貯存宿主。沙門菌中包括雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌以及其他有鞭毛能運動的沙門菌是禽沙門菌病的三大病原菌[11]，其中引起禽副傷寒的沙門菌包括腸道沙門菌等能感染其他動物并能通過受感染的產品傳播給人類，引起人沙門菌感染和食物中毒，因此具有重要的公共衛生意義[12-14]。本試驗從該場患病朗德鵝上分離出1株腸道沙門菌和2株大腸桿菌，接種小鼠出現了明顯的臨床癥狀和死亡，并從發病或死亡小鼠心臟和肝臟等組織中分離到病原菌，證實了分離株的毒力，這表明本次鵝場暴發的致死性雛鵝疫病是由大腸桿菌和腸道沙門菌混合感染所致。另外，通過對分離株16S rRNA序列進化分析表明，分離株可能存在著感染豬和人的潛在公共衛生風險。

大腸桿菌和沙門菌混合感染畜禽比較普遍，混合感染加重病情并升高了死亡率，也導致臨床診斷和防治的困難。從藥敏試驗結果可知分離菌株存在嚴重的多重耐藥性問題，李琳等[15]報道了130株雞源大腸桿菌中有90.8%的菌株是多重耐藥菌株；陳春林等[16]對重慶地區養雞場大腸桿菌、沙門菌的耐藥情況進行了試驗，結果發現110株大腸桿菌中80.0%為多重耐藥株，8株沙門菌中100%為多重耐藥株。彭峻烽等[17]對成都鴨屠宰生產污染沙門菌耐藥狀況調查，發現99株沙門菌中多重耐藥率達47.47%。盡管當前防治細菌性傳染病，抗菌藥物仍然是首選工具之一，但多地報告的禽源大腸桿菌和沙門菌耐藥情況，已顯示出當前我國養禽業利用抗菌藥物來防控禽大腸桿菌病和沙門菌病的狀況十分不樂觀。實際上，細菌可通過天然克隆與表達系統，即整合子-基因盒將耐藥基因傳遞或捕獲外源耐藥基因，造成細菌耐藥性的傳播，食源性途徑是耐藥菌株(包括其耐藥基因)由動物到人的主要傳播途徑，這將對動物疾病的防控以及公共衛生安全形成潛在威脅[18-20]。

為應對細菌耐藥性這樣的全球性公共衛生問題，目前國家已經出臺了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃(2017—2020)年》[21]，其目的就是為了有效應對動物源細菌耐藥挑戰，提高獸用抗菌藥物科學管理水平，保障養殖業生產安全、食品安全、公共衛生安全和生態安全，保障人民群眾身體健康。從此次朗德鵝大腸桿菌和沙門菌混合感染及病原多重耐藥可以看到，細菌性傳染病的防治仍任重道遠，科學飼養管理、合理用藥以及“減抗”技術如細菌疫苗研制仍需繼續加強。