小反芻獸疫病毒抗體化學發光免疫分析檢測方法的建立

孫雨，宋曉暉，肖穎，王睿男，李秀梅，任雪建，李雪剛，魏巍，楊林，王傳彬*

(1.中國動物疫病預防控制中心，北京 大興 102600；2.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 400000；3.洛陽現代生物技術研究院有限公司，河南 洛陽 471000；4.登封市畜牧業服務中心，河南 登封 452470)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)，又稱“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種急性高熱、高度接觸傳染性疾病，主要感染小反芻動物，如山羊、綿羊、羚羊、美國白尾鹿等，其中以山羊最為嚴重，易感羊群的發病率和死亡率可達100%[1]。進入20世紀以來，在非洲利比亞、尼日利亞，以及中國、巴基斯坦等亞洲多地均有發生過PPR的報道[2-4]。目前尚無有效藥物治療PPR，對該病的成功控制策略主要依賴于疫苗免疫，而PPRV抗體水平的檢測是疫苗免疫效果評價的主要方法[5]。目前現有的標準診斷技術主要包括病毒分離鑒定、PCR以及競爭ELISA抗體檢測方法等。最近幾年，PPR診斷技術在國內外已有大量研究報道，相繼建立了多種檢測PPRV的新型方法，主要包括熒光免疫血清學方法和實時熒光定量PCR檢測方法等[6-8]。病毒的分離鑒定與血清中和試驗是OIE診斷PPRV的金標準，這2個方法雖然較為準確，但需要耗費約幾天的時間才能獲得結果，并且操作技術復雜，生物安全要求高，不適用于基層獸醫快速診斷需求。反轉錄PCR和實時定量PCR已經廣泛用于檢測PPRV，但這2種方法需要專業人員在專業的實驗室內開展，也給基層檢測人員診斷PPR帶來了一定的困難。血清學檢測主要以ELISA為主，檢測穩定性與特異性具有一定的局限性。本研究建立的化學發光免疫分析方法采用競爭原理，將PPRV的N蛋白作為包被抗原，包被于化學發光酶標板上，待檢血清與酶標單抗同時加入到化學發光酶標板中，二者競爭性地與N蛋白上的相應表位結合，最后加入化學發光底物，讀取發光值，從而計算出動物血清中PPRV抗體含量，并判斷陰陽性結果。由檢測結果判定被檢動物體內的PPRV抗體含量，具有較高的實用價值和推廣價值。

1 材料與方法

1.1 材料

PPRV N融合蛋白抗原由中國動物疫病預防控制中心(農業農村部獸醫診斷中心)制備保存；進口PPRV抗體ELISA檢測試劑盒購自法國IDVET公司；脫脂奶粉購自美國Oxoid公司；魯米諾化學發光底物，購自洛陽現代生物技術研究院有限公司；化學發光酶標板，購自美國Thermo公司；10%的胎牛血清、細胞培養基與相關細胞培養試劑購自美國Gibco公司；陰性與陽性樣本血清由中國動物疫病預防控制中心(農業農村部獸醫診斷中心)保存。

1.2 PPRV單克隆抗體的制備及純化

1.2.1 雜交瘤細胞繁殖

將生產用細胞株2E5C4(中國動物疫病預防控制中心菌毒種保藏室保存)，用含有15%胎牛血清的高糖型DMEM培養液(pH=7.0)制成細胞懸液，置37 ℃、含5% CO2培養箱中培養，48～72 h，細胞能夠穩定分裂繁殖，可長成單層。

1.2.2 小鼠腹水制備

選取12～16周齡健康雄性BALB/c小鼠，按0.5 mL/只腹腔注射弗氏不完全佐劑，7～10 d后每只小鼠腹腔接種l×106～5×106個2E5C4株雜交瘤細胞，經7～10 d后可見小鼠腹部明顯膨大，無菌操作采集腹水。采集的腹水以8 000 r/min離心10 min，棄去上層脂肪層，收集中層腹水，-70 ℃凍存備用。

1.2.3 單克隆抗體的純化

采用辛酸飽和硫酸銨沉淀法，對制備的含有單克隆抗體的腹水進行純化，純化后的單克隆抗體無菌定量分裝，-20 ℃以下保存備用。

1.2.4 單克隆抗體HRP標記

稱取2 mg HRP溶解于0.5 mL蒸餾水中，加入0.5 mL新配的0.06 mol/L NaIO4溶液，4 ℃避光30 min。加入160 mmol/L的乙二醇 0.5 mL，室溫放置30 min。加入純化的單抗2 mg，混勻。將上述溶液裝入透析袋中，置2 000 mL的PBS(pH=7.0)緩沖液中透析，4 ℃攪拌過夜。透析液吸至15 mL的離心管中，加0.2 mL新配的5 mg/mL NaBH4液，混勻，4 ℃放置12 h。將得到的產物用分子篩進行層析，將未和單抗結合的辣根過氧化物酶去除。

1.2.5 酶結合物的制備

將制備的濃度為1 mg/mL酶標單克隆抗體用酶結合物稀釋液按1∶8 000稀釋，攪拌均勻，無菌分裝，12 mL/瓶，置2～8 ℃保存。

1.3 樣本采集及處理

采集靜脈血時，每頭豬、牛或羊使用一個注射器。進行靜脈無菌采血，不少于2 mL。傾斜放置于室溫中靜置2～4 h，待血液自然析出血清，必要時可低速離心(3 000 r/min離心10～15 min)，分離血清。

1.4 化學發光檢測步驟

①包被：將N重組蛋白用包被緩沖液稀釋到1.5 μg/mL，以100 μL/孔的量加入化學發光酶標板中，置2～8 ℃包被16 h。②洗板：棄去包被液，將25倍濃縮洗滌液稀釋成1倍洗滌液，用(280±20)μL洗滌液洗滌板孔，洗板2次，每次洗滌后應棄去孔內的液體，最后1次洗滌液棄去后，將包被板在吸水紙上拍干，直至孔內無殘留洗滌液。③封閉：每孔加入150 μL封閉液，置于37 ℃封閉2 h，棄去封閉液，在吸水紙上拍干。④干燥：置于37 ℃干燥3～5 h，將包被板裝入鋁箔袋，加干燥劑，抽真空，置于冰箱2～8 ℃保存備用。⑤樣品稀釋：在血清稀釋板中，用樣品稀釋液將待檢樣品按照1∶20比例進行稀釋。⑥加樣：取出包被板，每次試驗需設置系列校準品6孔。首先在血清稀釋板上依次加入校準品1～6各60 μL，其余各孔依次加入待檢樣品各60 μL，再向以上各孔均加入60 μL 酶結合物，震蕩混勻。每孔吸取100 μL轉移至包被板對應孔內。⑦溫育：置37 ℃恒溫培養箱中溫育(30±1)min。⑧洗板：將各孔的液體棄入廢液筒，用(280±20)μL洗滌液洗滌板孔，共洗滌5次，每次洗滌后應棄去孔內的液體，最后1次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液在吸水紙上拍干。⑨加入底物：每孔各加入100 μL的魯米諾化學發光底物，振蕩混勻。⑩靜置：在15～25 ℃條件下避光靜置5 min，靜置后15 min內用化學發光儀讀取發光值。

結果計算方法：以校準品1至校準品6的發光值為縱坐標，對應的抗體劑量值(0、10、20、50、100、200 NCU/mL)為橫坐標，通過ELISACalc軟件繪制校準品的四參數擬合曲線，四參數模式為Y=(a-b)/[1+(x/c)*b]+d。將樣本的發光值代入校準曲線計算，即可得出樣品中抗體的含量。

1.5 試驗成立條件與結果判定

將6個校準品的發光值與對應抗體劑量值進行四參數擬合，R2≥0.99，試驗成立;否則，試驗不成立。如果待測樣品中抗體含量<臨界值40 NCU/mL，樣品應判定為PPRV抗體陰性；如果樣品中抗體含量≥臨界值40 NCU/mL，則判定為PPRV抗體陽性。

1.6 質控血清的檢測

采用化學發光免疫分析檢測方法，對12份質控血清(其中強陽性血清3份，陽性血清3份，弱陽性血清3份，陰性血清3份)進行檢測，重復3次，并用進口的PPRV抗體ELISA檢測試劑盒作為對照，比較2種檢測方法對質控樣本的檢出率。

1.7 交叉試驗

采用O型口蹄疫病毒陽性血清、羊痘病毒陽性血清、羊口瘡病毒陽性血清、布魯菌陽性血清和大腸桿菌陽性血清，進行血清中和試驗驗證PPRV抗體為陰性后，用建立的化學發光方法對上述血清進行檢測，判斷是否具有交叉反應。

1.8 最低檢出量試驗

將PPRV敏感性陽性質控血清按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048進行倍比稀釋，采用化學發光免疫分析檢測方法與進口的PPRV抗體ELISA檢測試劑盒同時對上述血清進行檢測，重復3次。

1.9 重復性試驗

采用建立的化學發光免疫分析檢測方法對12份經過鑒定的陽性血清在同批次板和不同批次板上分別進行檢測，平行測定5次，計算批內、批間變異系數。

1.10 符合性試驗

采用建立的化學發光免疫分析檢測方法與進口的PPRV抗體ELISA檢測試劑盒對送檢的338份血清進行檢測，計算其符合率。

1.11 數據統計與分析

試驗數據經SPSS 18.0進行統計分析，結果用“平均值±標準誤”表示，并計算變異系數。變異系數=(標準偏差/平均值)× 100%。

2 結果與分析

2.1 PPRV單克隆抗體的制備與純化分析

SDS-PAGE檢測發現在55與27 kDa處分別出現PPRV單克隆抗體重鏈與輕鏈的目的條帶，表明試驗成功制備了針對PPRV的單克隆抗體，且純化后的單克隆抗體純度在90%以上，結果見圖1。

M.蛋白質分子質量標準；1.PPRV單克隆抗體(小鼠腹水)

2.2 質控血清檢測

采用化學發光免疫分析檢測方法，對12份質控血清進行檢測，重復3次，檢測結果顯示該檢測方法的3次重復試驗和進口檢測試劑盒的陽性檢出率均為100%，見表1。

表1 化學發光免疫分析檢測方法對質控血清的檢測結果

2.3 交叉試驗

用建立的化學發光免疫分析檢測方法對交叉試驗對照血清進行檢測，結果全部為陰性，見表2。

表2 化學發光免疫分析檢測方法交叉試驗

2.4 最低檢出量試驗

將陽性質控血清進行倍比稀釋，采用化學發光免疫分析檢測方法對上述血清進行檢測。結果表明進口PPRV ELISA抗體檢測試劑盒對陽性質控血清檢測最低稀釋度為1∶512，化學發光免疫分析檢測試劑盒最低檢出量為1∶1 024，說明該檢測方法的敏感性優于進口ELISA檢測方法。結果見表3。

表3 化學發光免疫分析檢測方法最低檢出量試驗

2.5 重復性試驗

采用建立的快速定量檢測方法對12份血清在同批次板和不同批次板上分別進行檢測，平行測定5次，計算批內、批間變異系數。結果表明，本試驗建立的化學發光方法批內重復系數均小于10%，批間重復系數均小于15%，該方法具有良好的重復性。結果詳見表4。

表4 化學發光免疫分析檢測方法重復性試驗

2.6 符合性試驗

選擇抽取338份樣本，使用本研究建立的PPRV抗體化學發光免疫分析檢測方法與進口的PPRV ELISA抗體檢測試劑盒進行比對。檢測結果顯示，2種方法的總符合率為90.33%，陽性符合率為95.02%，陰性符合率為82.08%。結果見表5。

表5 符合率統計

3 討論

PPRV感染能力強，傳播途徑多，其引起的PPR在多個國家和地區發生過大范圍流行，嚴重阻礙了養羊業的發展。該病一旦發生，會給養殖戶經濟造成重大損失，因而及時快速診斷十分重要[1,5]。目前我國現有的PPRV檢測國標《小反芻獸疫診斷技術》(GB/T 27982-2011)主要涉及PPRV的分離鑒定、血清中和試驗、病毒核酸的分子生物學檢測方法以及病毒抗體的ELISA檢測方法[5-6]。但病毒分離鑒定、血清中和試驗、病毒核酸的分子生物學檢測方法的局限性在于對實驗室條件和人員操作水平有較高的要求，檢測速度相對較慢。在血清學檢測方面，ELISA方法作為傳統的檢測技術之一，各級實驗室普及性較高，但檢測穩定性與特異性具有一定的局限性。近年來國內外學者依據病毒的N、H和F等特異保守抗原建立了多種ELISA檢測技術，例如C-ELISA、I-ELISA等檢測方法，在敏感性與特異性方面取得了一些進展[9-11]。而化學發光免疫分析檢測方法與傳統ELISA對比，兩者操作步驟、檢測速度相近，但化學發光方法的優越之處在于發光底物的靈敏性更好[12]。在人類醫學診斷檢測方面，已經成功建立了化學發光免疫分析法用于檢測乙肝病毒感染標志物等多項成熟的技術，無論檢測的敏感性與特異性都明顯優于傳統ELISA方法[13]。

化學發光免疫分析方法是將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術。該方法將抗原、抗體同樣本結合，而有的化學發光免疫分析檢測方法由磁珠捕捉形成反應物，然后再加入發光促進劑，加大反應物自發光速度和強度，用發光信號測量儀測量光子數量進行定量分析。化學發光免疫分析檢測方法是繼放免分析、傳統酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發展起來的又一項新型的酶免疫分析檢測技術。化學發光方法精確度高，無污染，檢測速度快，技術日益成熟，代表了免疫診斷的發展方向[14]。目前尚沒有敏感性與特異性更高的PPRV抗體化學發光免疫分析檢測方法見于國內外文獻報道之中。本研究使用了PPRV N蛋白作為包被抗原，純化并標記針對N抗原的單克隆抗體建立了PPRV抗體化學發光免疫分析檢測方法。與市售的PPRV抗體ELISA檢測試劑盒相比，本研究建立的化學發光檢測方法，在保證檢測特異性的同時，靈敏度方面比市售ELISA試劑盒更為敏感，陽性血清樣品檢出率也更高，并且可以實現抗體的定量檢測，所以檢測性能方面更具優勢，具有較好的市場應用前景。

綜上，本研究建立的PPRV抗體化學發光檢測方法敏感性高，特異性強，操作簡單、快速，適用于基層各級獸醫部門和出入境檢驗檢疫局對PPRV血清抗體的快速定量檢測，為PPR的防控和凈化提供了重要技術手段。