基于混池測序的犬恐懼行為相關變異位點的初步篩選

朱程程，馬大君，程占軍，曹錦和，孫勇，萬寧，李翔

(公安部南京警犬研究所/警犬技術公安部重點實驗室，江蘇 南京 210012)

隨著我國警犬技術的快速發展，警犬的使用范圍從過去的刑事偵查、維護治安擴展到血跡搜索、搜毒搜爆、安檢和消防搜救等領域，而史賓格犬由于興奮性高、體型小、嗅覺靈敏、耐力持久等特點，在這些新興領域的使用中發揮著不可替代的作用。但是在膽量方面，史賓格犬的膽量天生較小，容易表現出恐懼行為，以至于部分史賓格犬不能被訓練成工作犬投入到實戰工作中去。

犬的恐懼行為與遺傳、環境、表觀因子等多種因素有關，欲想提高犬的膽量，降低恐懼行為，可以通過傳統育種和分子育種2種方法。雖然通過傳統育種方法可以在一定程度上提高膽量，但是傳統育種方法具有周期長，且一旦品種育成就不易引入其他新的遺傳性狀等缺點。而隨著現代生物技術的發展，分子育種顯示出越來越強大的生命力，逐漸成為動物育種的趨勢和主流。降低犬天生的恐懼行為，就要尋找與犬膽量性狀相關的基因，探索犬膽量性狀遺傳機理，這能為從分子水平上對史賓格犬膽量性狀進行遺傳改良提供理論依據。

基因組遺傳變異形式主要有單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)、插入缺失(insertion-deletion, InDel)等，對基因組內遺傳變異的發掘和研究是開發分子標記和功能基因定位的基礎。SNP是最常見的遺傳變異形式，約占全部變異的90%左右，各物種內都已經鑒定出海量的SNP，這些SNP被廣泛用于基因遺傳定位和群體進化研究。InDel是基因組中數量僅次于SNP的第二大類遺傳變異，如果按照總長度計算，InDel甚至和SNP相當。

目前對于恐懼行為方面的研究主要集中在小鼠上。有研究表明，終紋床核和內側杏仁核都是與嚙齒類動物天生恐懼行為相關的大腦區域，抑制大腦這2個區域的活動能夠減少嚙齒類動物天生的懼怕感[1]。酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)是一類可被胞外H+激活的非選擇性陽離子通道，ASIC1a參與突觸可塑性、學習記憶及條件性恐懼情緒等生理過程[1]。過表達ASIC1基因會使小鼠條件性恐懼行為增強[2]。另一方面，ASIC1a在小鼠天生恐懼感的形成等過程中，同樣發揮重要作用[3]。Zhu等[4]研究證明，杏仁核EphB2信號調控小鼠先天性恐懼行為。Shumyatsky等[5]研究報道，敲除小鼠微管解聚蛋白(stathmin)基因后，會顯著減少先天性恐懼行為。

分離群體混合分析是基因定位的有效手段之一。20世紀末，研究人員將具有多態性的分子標記與極端表型材料的DNA混池結合，能夠成功鑒定與目標性狀相關聯的位點[6-7]。隨著生物技術的不斷發展，研究人員將分離群體混合分析與高通量測序技術相結合，開發混池測序方法，目前該方法已在水稻[8]、大豆[9]等作物以及雞[10]、奶牛[11]等畜禽中得到廣泛應用。然而，混池測序在動物行為相關基因挖掘方面的研究較少，在犬恐懼行為相關變異位點和基因的挖掘方面未見報道。因此，本研究采用了混池測序方法對犬全基因組與恐懼行為相關的SNP和InDel進行篩選，以期發掘與犬恐懼行為相關的功能基因。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

本研究所用犬由公安部南京警犬研究所提供。對6～8月齡的犬進行嚴格的恐懼行為測試，根據測試結果選取恐懼行為極端差異的史賓格犬20條。采用前肢靜脈采血的方法，將采集的全血收集在含有EDTA抗凝血的采血管中，處理后保存至-80 ℃的冰箱。

1.2 方法

1.2.1 恐懼行為測試

恐懼行為測試包括5個項目，陌生人測試、光滑地面和槍聲測試[12]、雨傘測試和金屬易拉罐測試[13]。具體參考文獻[14]的研究方法。

1.2.2 DNA提取及檢測

使用Solarbio全血基因組DNA提取試劑盒從采集的犬全血中提取全基因組總DNA，依照說明書的要求及步驟提取血樣DNA。通過Nanodrop檢測DNA純度，OD260/280比值在1.6至1.8之間。利用1%的瓊脂糖凝膠對提取的DNA進行電泳，電壓為150 V，電泳時間為30 min，分析DNA質量。通過Qubit 2.0檢測樣品濃度。

1.2.3 樣品DNA分組混池

將采集的恐懼行為極端差異的20頭犬分為2組，其中恐懼行為極高的10頭設為高恐懼組(terrified group, FBH)組，恐懼行為極低的10頭為低恐懼組(slight fear group, FBL)組，并將2組群體的基因組DNA分別等量混合。

1.2.4 DNA池重測序篩選SNPs和InDels

DNA提取、檢測和混池結束后，送至奧維森基因科技有限公司，公司質量檢測合格后，構建插入片段為200 bp的測序文庫，再進行文庫檢測。文庫質檢合格后，選擇Hiseq TM 2500測序儀上機測序。

1.2.5 數據分析

1.2.5.1 數據質量控制

本研究使用FastQC軟件對原始數據進行質量評估，分別查看單堿基測序質量分布、測序錯誤率分布和序列GC含量分布等方面的信息，若某評估項目不合格，需要依據情況進行過濾，直到評估合格后進行后續數據分析。

1.2.5.2 序列比對參考基因組

本研究使用BWA把有效測序數據比對到參考基因組，然后用SAMtools[15]來檢測SNP，只保留測序產生的短序列(reads)支持數大于等于4，比對質量值≥20的結果，且過濾Gap附近5 bp范圍內的SNP，過濾SNP位點鏈偏向性(Pvalue<10-4)。本研究利用ANNOVAR軟件[16]對SNP和InDel進行注釋分析。

1.2.5.3 與史賓格犬恐懼行為相關SNP和InDel位點挖掘

由DNA混池全基因組重測序技術可得到大量SNPs和InDels，為保證準確性，將對篩選出的SNPs和InDels進行進一步的篩選。篩選條件[11]為排除FBH組和FBL組相同SNPs和InDels；SNPs和InDels位點位于外顯子區域；SNPs和InDels位點變異類型選取非同義突變；1個基因出現多個位點變異的SNPs和InDels；樣本基因型為雜合變異；測序深度大于40，測序深度越深，變異位點準確性越高。

2 結果與分析

2.1 20條史賓格犬基因組DNA檢測

20條史賓格犬基因組DNA檢測結果如圖1所示，由圖可知犬基因組DNA長度為21 kb。條帶亮度尚可，基因組DNA可用于后續試驗。

M1、M2.DNA Marker；1～20.第1～20號犬的基因組DNA

2.2 測序數據質控

根據公司提供的數據資料，使用FastQC軟件對原始數據進行質量評估，結果表明，2組測序數據堿基質量值均在Q30～40之間，測序數據錯誤率在0.1%以下。FBH和FBL2組的AT，GC含量，基本上處于接近狀態。測序數據過濾后，FBH組可用reads數為95.68%，FBL組可用reads數為95.16%。所有樣本的數據量足夠，測序質量合格，GC分布正常，建庫成功。

2.3 基因組比對分析

將樣本序列與參考基因組序列進行相似性比對，覆蓋深度和覆蓋度可以直接反應測序數據的均一性及參考序列的同源性。

由表1可知，2組樣本的比對率為100%，對參考基因組的平均覆蓋深度分別為10.06X和12.67X，1X覆蓋度在99.58%和99.63%。由此可知，reads與參考序列比對結果正常，可用于后續的試驗。

表1 測序深度及覆蓋度統計

2.4 SNP檢測

由表2可知，FBH組外顯子區域發生突變位點31 226個，其中非同義突變13 232個。FBL組外顯子區域發生突變32 698個，其中非同義突變13 808個。

表2 SNP檢測和注釋結果

2.5 InDel檢測

由表3可知，FBH組外顯子區域InDel位點共有1 697個，FBL組外顯子區域InDel位點共有1 794個。

表3 InDel檢測和注釋結果

2.6 SNP和InDel篩選

根據SNP和InDel篩選條件篩選出以下SNP和InDel位點。具體信息見表4和表5。通過1.2.5.3中篩選條件，共篩選出14個SNP位點，2個InDel位點，這16個位點位于9個基因上。

表4 SNP信息

表5 InDel 信息

3 討論

3.1 混池測序數據的影響因素

混池測序結果的分析對犬恐懼行為相關變異位點的篩選至關重要，其影響因素也較多。犬恐懼行為強弱的精準判斷是混池測序的基本要求，若判斷不準確，則會影響混池測序的分析結果。此外，測序數據產出過程中文庫構建、文庫質檢等每個環節都會對數據質量產生影響，而高質量的測序數據是得到可靠分析結果的必要保障。因此，在混池測序數據分析之前，應首先根據一定的篩選條件對原始數據進行篩選，并且對測序數據的質量進行評估，若評估出現問題，則應進行適當處理。

3.2 SNP和InDel位點的篩選

SNP選擇時是根據特定的條件進行的篩選，主要考慮的是非同義突變。非同義突變是指DNA鏈上的堿基發生改變會導致氨基酸序列的改變，進而導致蛋白質的變化。非同義突變會導致蛋白功能發生變化。而同義突變的堿基并不會引起氨基酸的變化，從而也不會影響蛋白質的功能，因此，篩選會導致非同義突變的SNPs意義更大，非同義突變的SNPs是首要選擇。

雖然目前的高通量測序技術的準確度相對較高，但仍存在一定程度的測序錯誤[17]。因此，在篩選測序數據結果的時候需要選擇合適的測序深度的數據。本研究選擇測序深度大于等于40的SNP和InDel位點，與李金霞[11]在篩選中國荷斯坦奶牛SNPs位點的測序深度篩選條件相一致。

3.3 突變位點所在基因的相關研究

本研究通過混池測序的方法篩選出的14個SNP位點和2個InDel位點中，大部分突變位點位于新基因上，其中有2個SNP位點位于MUC6基因上。MUC6是一種編碼黏蛋白的基因，腫瘤組織中MUC6多出現異常表達[18]。有研究發現，慢性神經退行性疾病阿爾茨海默病與MUC6基因的遺傳多態性相關[19]。本研究結果表明，MUC6基因上有2個SNP位點與犬恐懼行為相關，關于MUC6基因對犬恐懼行為的影響需做進一步的驗證。

近年來，人們主要采用芯片雜交技術篩選犬特定性狀和疾病差異表達基因[20-22]，很少利用混池測序的方法來篩選犬特定性狀相關變異位點。本研究利用DNA混池測序的方法分析恐懼行為極端差異史賓格犬的差異變異位點，共獲得14個SNP位點和2個InDel位點，由于DNA混池測序的樣本量每組只有10個，樣本量較少，試驗結果可能不具備足夠的說服力。因此，關于篩選位點對犬恐懼行為的影響還需要深入研究，并通過擴大群體進行驗證，以確定與犬恐懼行為遺傳效應相關的SNPs，為犬遺傳育種改良提供理論依據。